天津科大微生态团队解析植物乳植杆菌CGMCC8198（TCCC11824）温度胁迫应答分子机理

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   研究背景简介   

BACKGROUND INTRODUCTION

  随着益生菌市场的不断扩大，各种各样的益生菌商品纷纷出现，然而，如何确保益生菌制剂及应用过程中保持有足够数量的活菌数，是工业应用所面临的普遍问题之一。

  其中，益生菌在工业生产（例如喷雾干燥、冷冻干燥）及储运过程中会经历高温或低温的温度胁迫，会使得益生菌在应用过程中的生长和代谢受到抑制，从而影响产品功能的发挥和高效活性的利用。另一方面，益生菌的温度胁迫应答基因元件，也将在分子生物学及基因工程中有重要的应用价值。

  因此，探究益生菌抗温度胁迫机制，将有助于：（1）耐受高温或低温的益生菌优良菌株的筛选；（2）鉴定温度诱导性启动子，可结合荧光蛋白等构建报告分析系统，用于益生菌发酵、制剂、储运工艺参数及原辅料配伍的高通量可视化分析评价，从而指导工艺优化；（3）温度诱导性启动子还可用于构建益生菌基因工程表达体系，对于性质不稳定的蛋白质多肽类药物的可控基因工程表达及口服递送系统具有重要意义。

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所用到的主要方法

METHODS   

（1） 转录组学

（2）qRT-PCR

（3）基因工程表达

（4）菌种驯化

（5）微囊制备

（6）流式细胞术

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研究内容简介主要内容摘要

ABSTRACT

  2023年，天津科技大学微生态与分子药理研究团队在《Food bioscience》（食品科技2区，IF 5.318）发表了题为“Transcriptome analysis and functional gene identification reveals potential mechanisms of heat stress response of Lactiplantibacillus plantarum CGMCC8198”的论文，文章第一作者为达佳毅、席茂盛两位并列，通讯作者为罗学刚教授。文章主要内容为：植物乳杆菌是一种重要的益生菌，广泛应用于功能性食品中。在制造过程中，热冲击过程会严重影响益生菌的存活率，对环境的适应性应答能够增强细菌对应激胁迫的抵抗力。在本研究中，转录组学和生物信息学分析的结果显示adhE-like、hisE、ykuN、folB等基因可能与植物乳杆菌CGMCC8198的耐热性有关。将这些基因在大肠杆菌中进行异源表达，重组菌在高温下的存活率、疏水性和膜完整性也得到了显著提高。此外，通过筛选菌株经过多轮驯化，获得了耐热性较好的驯化菌株，qRT-PCR显示，驯化菌株经过高温处理后，adhE-like等基因的表达也有相应改变，表明这些基因与乳酸菌的耐热性有关，可作为耐热性益生菌筛选的标志物。
  此外，在此前，该团队还在《食品与发酵工业》发表了题为“β -羟脂酰-ACP 脱水酶启动子的克隆及其冷激调节作用分析”，文章第一作者为周成慧，通讯作者为罗学刚教授。该文章主要内容为：温度对乳酸菌储存和应用有重要影响，为挖掘乳酸菌温控启动子以及探索冷激反应的分子机制，对植物乳杆菌CGMCC8198在4和37℃处理后的转录组测序数据进行了分析，并对其中的差异基因β-羟脂酰-ACP脱水酶编码的fabZ基因表达情况进行验证，进一步应用MEGA7.0软件分析其进化亲缘关系。再通过BPROM、BDGP、IPSW以及weblogo3.0对基因上游区域进行预测，最后克隆启动子区域构建以增强绿色荧光蛋白为报告基因的启动子报告分析质粒，转化大肠杆菌进行低温诱导分析。结果发现fabZ基因低温刺激后上调，生物信息学结果也显示此基因与低温应答有关系；在基因上游500bp区域有强启动子，且启动子中的-10区（TGTAAC）和-35区（TTACCG）6个核苷酸的位置与经典的-10区、-35区相似；大肠杆菌低温诱导实验表明在14℃刺激20、40、60min后含fabZ启动子菌株的荧光相对强度分别是37℃时的1.30、2.38和1.42倍。该研究首次发现植物乳杆菌的fabZ基因具有低温上调特性，为探究乳酸菌冷激应答与fabZ基因功能机理及构建乳酸菌低温诱导表达载体奠定一定的基础。
  综合一些其它结果，综合而言，该团队围绕益生菌的温度胁迫，主要有如下发现：  （1）结合基因组及转录组分析：共在植物乳杆菌CGMCC8198（TCCC11824）鉴定出192个温度胁迫应答基因，其中82个低温胁迫下的差异表达基因和110个高温胁迫下的差异表达基因，这些基因可以改变益生菌在温度胁迫下的细胞膜完整性等参数，从而影响温度耐受能力；  
（2）挖掘鉴定了fabZ等一系列乳酸菌温度诱导启动子及组成型启动子，以及与抗温度胁迫有关的功能基因，这些基因，可用于益生菌抗温度胁迫能力的分析及菌株的筛选参考；  
（3）经过驯化，得到了耐热能力进一步提升的益生菌株；  
（4）优化建立了植物乳杆菌CGMCC8198微胶囊制备工艺，优化后的微胶囊具有良好耐受性及稳定性。高温处理后，相关基因表达上调，能够增强微胶囊的保护效果；  
（5）应用温度诱导性启动子调控的EGFP，建立了一种可用于检测冷冻干燥、喷雾干燥工艺效果、筛选保护剂等的高通量可视化评价模型。