双歧杆菌胞外多糖研究进展

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    摘要：双歧杆菌是一种众所周知、使用范围很广的商用益生菌，其生长繁殖贯穿人的整个生命过程。有研究表明双歧杆菌具有益生功能的主要分子机制依赖于双歧杆菌自身分泌的胞外多糖。尽管一些细菌胞外多糖已经商业化用于食品和医药保健品等领域，如黄原胶、透明质酸和右旋糖苷等，但双歧杆菌等常用益生菌的胞外多糖还鲜见有商业化应用的报道。本文综述了双歧杆菌胞外多糖的合成分子机制、单糖组成及其理化性质，分析了双歧杆菌胞外多糖对肠道菌群的调节作用，阐述了双歧杆菌胞外多糖在抗氧化、改善和提高宿主免疫、抗过敏、抗肿瘤以及降低胆固醇等方面所体现出的益生功能。同时也对双歧杆菌胞外多糖分子机制研究和产业化开发方面存在的一些问题进行了讨论。

肠道菌群已渐渐被描述为一个“万能的功能器官”，通过肠－肝轴和肠－脑轴等与身体的其他器官发生相互作用，从而影响人体的健康状况。据报道，肠道菌群的变化与肥胖、糖尿病、肝硬化、心血管类疾病、神经类疾病等密切相关[1]。很多具有调控肠道菌群的植物源性多糖和寡糖在临床治疗中已成为畅销产品[2]。尽管诸如黄原胶、透明质酸和右旋糖苷等一些细菌的胞外多糖已经商业化用于食品、医药卫生和保健品领域[3]，但双歧杆菌和乳酸菌等常用益生菌的胞外多糖均还鲜见有商业化应用的报道。

双歧杆菌作为人体肠道中最重要的正常菌群之一，具有维持肠道菌群平衡、促进肠道蠕动、延缓机体衰老、提高免疫力、抗感染、抗肿瘤、控制内毒素、降低胆固醇等极其重要的生理功能[4]。其生长繁殖贯穿人的整个生命过程，尤其在青壮年以及长寿老人体内双歧杆菌的相对比例较高[5]。研究表明双歧杆菌分泌的胞外多糖可能是双歧杆菌发挥其益生功能的主要分子机制之一，许多科学家也通过实验研究证明双歧杆菌胞外多糖具有调节肠道菌群、抗氧化、改善和提高免疫力、抗过敏、抗肿瘤以及降低胆固醇等益生功能[6]。鉴于双歧杆菌公认的益生功能与安全性，及其胞外多糖抗炎抗氧化、促进宿主免疫反应和抵抗病原菌感染等生物学功能，双歧杆菌胞外多糖将具有广泛的应用价值与开发前景。本文对双歧杆菌胞外多糖合成的分子机制、单糖组成与理化性质及其对肠道菌群的调节和益生功能作一综述。

1、双歧杆菌胞外多糖合成的分子机制及其单糖组成

1.1 双歧杆菌胞外多糖合成的分子机制双歧杆菌胞外多糖（EPS）是指由双歧杆菌发酵产生的，分泌于细胞外的，常渗入培养基中的一种糖类化合物。研究报道B. longum JBL05和B. animalis subsp. lactis IPLA-R1产生的多糖主要分泌到细胞外，而其他双歧杆菌如B. longum YIT 4028、B. adolescentis YIT 4011、B. animalis subsp. lactis RH、B. breve YIT 4010、B. bifidum BIM B-465、B. catenulatum YIT 4016和B. infantis ATCC 15697等产生的胞外多糖主要粘附在细胞壁上[7]。双歧杆菌胞外多糖属于异型多糖，由多种单糖组成糖链重复单元，其合成主要以低聚糖苷链为活性前体，在糖基转移酶的作用下将前体物顺序转移至脂类载体，最后在聚合蛋白及分泌蛋白的作用下合成多糖并将其分泌到胞外。

全基因组测序分析表明，大部分双歧杆菌的基因组序列中都含有一个胞外多糖合成基因簇（EPS基因簇），包含大约20个与胞外多糖合成相关的基因[8-9]，且EPS基因簇在不同菌株间存在着结构多变性[7]。从功能组成上来看，该基因簇由编码重复单元转运子蛋白基因、编码多糖重复单元聚合蛋白基因以及多糖链长度控制基因三个区域构成[10]。EPS基因簇中编码重复单元转运子蛋白的基因位于基因簇两端，所编码的转运蛋白具有翻转酶功能，是膜整合蛋白家族成员之一，能将单糖单元从细胞膜膜内翻转到细胞膜外。双歧杆菌胞外多糖EPS基因簇中编码的聚合蛋白负责把转运出的糖链重复单元聚合后形成长链多糖分子。同时双歧杆菌胞外多糖EPS基因簇编码9～14个跨膜螺旋，预测该段基因可能还同时控制着胞外多糖的输出与转运。双歧杆菌胞外多糖糖链长度控制基因编码的蛋白属于Etk-like酪氨酸激酶类，可以作为辅助蛋白在多糖重复单元跨膜以及聚合时控制糖链长度。关于糖链长度控制的假设有两种，一种认为糖链长度控制基因调控重复单元聚合酶活性从而影响糖链长度，另一种认为糖链长度控制基因与重复单元聚合酶的复合状态影响糖链长度[10]。

胞外多糖的产量受培养基成分（如碳源、氮源、无机盐）、温度、CO2浓度等培养条件的影响。双歧杆菌胞外多糖的平均产量为每升几十至几百毫克不等[11]。双歧杆菌胞外多糖分离纯化方式一般为：8 000 r/min离心10 min除去菌体，上清液减压浓缩之后用三倍体积的无水乙醇4℃沉淀24 h。8 000 r/min离心10 min除去上清液，所得沉淀复溶于水，使用Sevage法去除蛋白三次后4℃条件下用水透析48 h。透析袋内溶液减压浓缩之后冷冻干燥[12]。

1.2 双歧杆菌胞外多糖的结构双歧杆菌胞外多糖（EPS）主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖和岩藻糖等组成[12-13]，含有羧基并且部分成盐，同时存在吡喃糖环内醚结构。半乳糖以4位连接为主，葡萄糖以2、3、4、6位连接为主。刚果红实验证明双歧杆菌胞外多糖可能具有螺旋结构[13]。双歧杆菌胞外多糖的水解选用质量分数为20%的硫酸在100℃条件下水解2.5 h，可以将多糖完全水解为单糖[12]。

2、双歧杆菌胞外多糖的理化性质

2.1 分子量 根据相关文献对双歧杆菌胞外多糖分子量的测定结果，其分子量为1.1×105~3.92×105 Da[14-15]。

2.2 酸碱度 双歧杆菌胞外多糖pH约6.5，属于酸性多糖，因此其在碱性溶液中不稳定，在酸性溶液中稳定[14]。

2.3 溶解性 双歧杆菌胞外多糖易溶于水，难溶于正丁醇、乙酸乙酯、乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂[14]。

2.4 凝胶性 双歧杆菌胞外多糖的黏度随其浓度的增加呈非线性增加。随着温度的升高黏度逐渐减小；随着温度的下降黏度逐渐增大，但是伴随温度的升高、下降，其黏度减小、增大的程度有差异，属于热不可逆凝胶[14]。

2.5 稳定性 温度对双歧杆菌胞外多糖的稳定性影响不明显。胞外多糖的稳定性更易受其溶液的pH影响，溶液pH为4～10时表现稳定，当pH升至12时，溶液中开始出现絮状悬浮物，溶液变混浊，黏度呈现跳跃性增加。部分离子对双歧杆菌胞外多糖稳定性也有一定影响，包括Cu2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Na+，其中Mg2+的影响较大，Na+的影响最小。因此，应用双歧杆菌胞外多糖作为食品添加剂使用时，可忽略食盐对其稳定性的影响，但应考虑其他金属离子对其性质的影响[14]。

3、双歧杆菌胞外多糖对肠道菌群的影响

3.1 双歧杆菌胞外多糖对其自身的作用双歧杆菌胞外多糖可以提高双歧杆菌对肠道表面的非特异性黏附，保护双歧杆菌能更好地耐受胆盐、酸以及肠道内的极端环境，使其更好的存活于胃肠道环境中[16-17]。同时双歧杆菌还可以通过分泌胞外多糖逃逸免疫吞噬，增强其生存能力[18]。在对双歧杆菌进行冷冻干燥的过程中，双歧杆菌胞外多糖包裹在菌体表面，对菌体产生保护作用，可以提高双歧杆菌在冷冻干燥过程中的存活率[19]。双歧杆菌胞外多糖除了对双歧杆菌自身的保护作用以外，体外实验也表明双歧杆菌胞外多糖可以刺激双歧杆菌数量的增殖和细菌多样性的增加[20]。

3.2 双歧杆菌胞外多糖对肠道菌群的影响

3.2.1 抑制条件致病菌的生长双歧杆菌胞外多糖通过断裂染色体DNA、抑制细菌二分裂增殖、破坏生物膜（线粒体膜和细胞膜）等方式，对肠球菌、肠杆菌的生长具有明显的抑制作用[21-22]。体外实验表明其对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、阪崎肠杆菌、单增李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、枯草芽胞杆菌等病原菌的生长有明显的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用尤为明显[23-24]。

3.2.2 促进潜在益生菌的增殖双歧杆菌胞外多糖可以作为肠道内其他菌属的发酵底物和生长基质，提高奇异菌属和乳杆菌的生物量和生物多样性，引起肠杆菌属和拟杆菌属数量和比例的变化，从而调节肠道菌群结构[25]。体外实验表明双歧杆菌胞外多糖在体外能够明显促进多种乳杆菌包括动物乳杆菌、约氏乳杆菌和罗氏乳杆菌等的增殖[20]，提高乳酸菌和总细菌的数量及生物多样性[23]。

3.2.3 影响肠道菌群的代谢 双歧杆菌胞外多糖通过影响肠道菌群的结构和数量以及影响代谢酶包括α-葡萄糖苷酶、酯酶、乳酸脱氢酶及氨肽酶等的活力而调节肠道菌群物质代谢能力。体外实验结果表明双歧杆菌胞外多糖浓度的增加可以明显提高肠道菌群对淀粉、蛋白和油脂的代谢能力[26]。同时双歧杆菌胞外多糖可以通过影响肠道菌群抗性相关基因的表达，提高肠道菌群对酸性环境和胆盐的适应性[16,26]。

4、双歧杆菌胞外多糖对宿主生理功能的影响

4.1 清除自由基与抗氧化功能 体内和体外实验均表明双歧杆菌胞外多糖具有明显、直接的抗氧化作用。体外实验发现双歧杆菌胞外多糖可以明显地抑制脂质过氧化，显著地清除DPPH、过氧离子以及羟自由基。体内试验发现双歧杆菌胞外多糖能够显著地提高血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、肝脏中的谷胱甘肽转移酶（GST）活性以及总的抗氧化能力，显著地降低丙二醛（MDA）活性、单胺氧化酶活性，减少脂褐质的累积[27-28]。其抗氧化的作用机制主要是通过吸附自由基中的氢原子和电子，抑制其构象，从而达到清除自由基的效果[29]。另一方面双歧杆菌胞外多糖还可通过解离H-O键结合的能量从而起到抗氧化的作用[30]。

4.2 提高机体免疫力双歧杆菌胞外多糖免疫功能强弱与其化学组成和理化性质相关。大分子量以及带中性电荷的胞外多糖通过抑制促炎症因子的分泌，发挥免疫抑制功能[31]。同时大分子量的胞外多糖在与肠道上皮细胞接触时能够引起树突状细胞即DC细胞的激活和分化，促进细胞因子释放，刺激耐受性DC细胞的产生。细胞因子和耐受性DC细胞共同介导初始T细胞分化为调节性T细胞，如FOXP3+CD25high Treg细胞等，从而控制效应T细胞所产生的过度免疫反应，发挥免疫抑制功能。小分子量以及带负电荷的胞外多糖通过刺激免疫细胞分泌IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ等细胞因子，发挥免疫促进功能[32]。胞外多糖能够对免疫细胞产生刺激作用是由于其结构上含有磷酸盐所致[33-34]。小鼠体内实验还证明双歧杆菌胞外多糖可以显著增强脾脏淋巴细胞的活性，提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力，增高小鼠血清半数溶血值HC50[35]，同时不会对小鼠的肝肾功能产生负面影响[23]。双歧杆菌胞外多糖还能与细胞表面的毒素受体竞争性结合，阻碍受体与毒素间的联系，或者捕获细菌毒素，避免毒素与受体结合，最终达到保护宿主细胞免受细菌毒素伤害的作用[36-37]。

4.3 抗过敏双歧杆菌胞外多糖通过形成黏液屏障，阻断过敏源与小肠上皮接触，直接阻止过敏反应发生。同时双歧杆菌胞外多糖通过促进肠道中乳杆菌的增殖，间接发挥抗过敏作用。小鼠实验中，过敏小鼠的肠黏膜被破坏，上皮通透性增加，对过敏小鼠使用双歧杆菌胞外多糖灌胃后，小鼠血清中引发过敏的细胞因子水平显著降低，组织切片结果显示肠道微绒毛结构和小肠壁得到有效修复，维持了肠道屏障的完整性[26]。

4.4 抗肿瘤双歧杆菌胞外多糖作为一种天然抗肿瘤药物，具有安全性高、毒副作用小、抑瘤效果好等优点[38-39]。双歧杆菌胞外多糖能够改变肿瘤细胞端粒酶限速因子hTERT mRNA表达量，调节钙离子在细胞内的浓度，抑制人体胃肿瘤细胞的生长，抑制作用呈剂量时间反应关系[40]。体外实验表明双歧杆菌胞外多糖可以抑制结肠癌细胞系HT-29和HCT-116的生长，推测这种抑制作用可能与抑制肿瘤细胞DNA合成的速率，降低肿瘤细胞的增殖能力有关[41]。青春双歧杆菌胞外多糖可以强烈抑制HT-29、SW480、Caco-2细胞系的生长，这种抑制作用呈现剂量依赖性，刺激RAW264.7巨噬细胞系大量产生肿瘤坏死因子TNF-α[42]。双歧杆菌胞外多糖的丁醇提取物能够诱导巨噬细胞活化，产生TNF-α和NO，抑制结肠癌细胞系的增殖[43]。以纳米粒子作为双歧杆菌胞外多糖的转运载体，胞外多糖对胃癌细胞BGC-823移植瘤的增殖抑制和促凋亡作用可以得到明显增强，提高双歧杆菌胞外多糖的抗肿瘤活性[44]。

4.5 降低胆固醇由于胞外多糖对消化水解酶具有耐受性，同时具有优良的持水性能，使得胆固醇可以粘附于胞外多糖之上，降低肠道对胆固醇的吸收[45]。2011年，Alpavc等在第36届FEBS国际未来生物医学会议上提出双歧杆菌的降血脂功能与双歧杆菌分泌的胞外多糖之间存在很大的关联性。Nakajima等分别用分泌胞外多糖和不分泌胞外多糖的菌种发酵牛奶饲喂大鼠，结果发现大鼠血清中的胆固醇含量存在明显差异。据此推断菌体所分泌的胞外多糖导致了胆固醇含量的差异[45]。

5、展望与讨论

相比于植物多糖，微生物胞外多糖具有很多独特的优良属性，它们安全无毒、理化性质独特、易与菌体分离、生产周期短、生产不受病虫害、地域和季节条件等限制，具有广阔的发展前景和一定的市场竞争力。许多微生物胞外多糖已被作为乳化剂、成膜剂、保鲜剂、胶凝剂等广泛的应用于医药、食品、石油、化工等多个领域[46-47]。对于双歧杆菌胞外多糖的研究报道自2000年之后陆续出现，由国外的研究人员率先报道，国内相关的研究较少。且目前研究较多的双歧杆菌胞外多糖主要集中在动物双歧杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌的一些菌株[10,14,26]。关于双歧杆菌胞外多糖也还有一些问题需要释疑：（1）关于双歧杆菌胞外多糖的单糖组成，除了半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖和岩藻糖外，是否还有其他单糖组成，其单糖的排列方式如何？（2）双歧杆菌遗传操作系统还不完善，而自然分离菌的胞外多糖产生能力又比较低，且以粘附在细菌壁上为主。如何低成本地获得高产双歧杆菌胞外多糖是实现其商业化应用的前提。（3）虽然有报道表明双歧杆菌胞外多糖对肠道菌群具有调节作用，但由于肠道菌群可以根据其优势菌群的含量不同而分为拟杆菌型、普雷沃菌型和杂合型等[48-50]，双歧杆菌胞外多糖对不同肠型人体肠道菌群的调节作用是否有特异性有待进一步研究。（4）有文章报道使用双歧杆菌胞外多糖可以调节血压，其对血压发挥调节作用的机理是什么？是通过降低胆固醇的方式来达到调节血压的效果吗？它对人体循环系统还有没有其他的益生功能？

综上所述，对于双歧杆菌胞外多糖的组成及其理化性质还有待进一步研究，以获得较为全面、综合的论断。其对不同肠型人群肠道菌群的调控作用可以通过肠道体外模型进行进一步研究。关于其益生功能，除了对消化、免疫系统的益生功能外，对人体其他系统或者组织器官的益生功能还有待使用临床检验、动物实验或者体外实验等研究方法做出更为全面的研究以发现其潜在的应用价值。