多糖水解酶的研究现状

hu123

多糖水解酶的研究现状

1 植物多糖和微生物多糖及其水解酶概况

植物通过光合作用对碳的固定作用为地球提供了取之不尽的可更新的资源，特别是植物中包含多糖为地球上啮齿动物等提供了主要营养来源，也为化学、食品、药品和饲料工业等提供了重要的新的化合物。许多应用于农业和工业的多糖，加工过程中利用的酶（包含多糖水解酶）也被从微生物制备得来，并且酶的理化性质、作用模式和合成的调节也有了较好的认识。
与植物多糖相比，尽管一些在食品工业用作凝胶剂，对微生物多糖（杂多糖）的结构和流变性质的知识知之甚少。微生物多糖可以是单一糖组成的匀质糖，也可以是 2 个或 4 个单糖组成的杂多糖。胞外多糖通常是线性分子，一些结构中它
们的支链长度不一。和植物多糖不同，微生物多糖的结构通常比较有规律，表明
它们是通过寡糖聚合而成的。
微生物多糖在其生态系统发挥重要作用，它使微生物适应不同的环境压力的重要因素。许多胞外多糖在致病微生物的粘合和感染过程发挥重要作用。在细菌感染过程，胞外多糖具有生物膜的功能，使细菌细胞免于巨噬细胞、抗体、化疗试剂的攻击. 抑制多糖的合成或消除多糖聚合体是治疗膜依赖感染菌引起的疾病的有效手段。因此需要能够溶解多糖酶。
关于作用于植物多糖的骨架和侧链的酶已经有比较多的介绍，但是降解微生物多糖的酶的报道却很少。由于缺乏这种酶，也限制了微生物胞外多糖的结构分析和实际应用。

2 纤维素的生物降解

纤维素分子是由葡萄糖分子通过 β-1,4-糖苷键连接而成的链状高分子聚合物，每个大分子中含的葡萄糖残基数一般为 8000-12000 个。天然的纤维素由排列整齐而规则的结晶区和相对不规则、松散的无定形区构成，其结晶度一般在30%～80%之间。纤维素构成植物细胞壁的主要成分，可占细胞干重的 20%～40%。纤维素可水解成葡萄糖。虽然如此，但是由于纤维素作为植物的支持结构的主要成分，其葡萄糖亚基排列紧密有序，形成晶体的不透水结构，因此纤维素不能溶于水，难以水解，而且无法作为动物和人类的直接营养源。少数动物如牛可以以纤维素为食物，那是因为它们的肠道中含有分解纤维素的微生物的缘故。而能够参与分解纤维素的酶统称为纤维素酶。
随着各种分离技术如分子筛、离子交换树脂、层析和电泳技术的发展，人们已经成功地将纤维素酶分离出不同的组分，纤维素酶是复合酶已经成为共识。从目前的研究看，纤维素酶中至少包括 3 类不同性质的酶，即纤维素内切酶、纤维素外切酶和纤维二糖酶。纤维素内切酶可以沿纤维素分子链随机地水解，而纤维素外切酶则只能从β-1,4-糖苷键纤维素分子链的一端(通常为非还原端)切断纤维素分子，并形成纤维二糖或葡萄糖。纤维二糖酶的作用是将纤维二糖水解成葡萄糖。纤维二糖酶对反应动力学的作用很大，因为内切和外切酶水解的主要产物为纤维二糖，随着反应的进行，纤维二糖的产物积累将使外切酶的活力受到抑制，要使反应高效率地进行，必须将纤维二糖转化成为其它形式，而纤维二糖酶恰恰承担了这个功能。

1950 年，Reese等对纤维素酶作用方式提出了一个著名的C1-Cx假说。即认为纤维素酶中的C1 酶首先作用于纤维素结晶区，使其转化成可被Cx酶作用的非结晶形式，Cx酶随机水解非结晶纤维素、可溶性纤维素衍生物和葡萄糖的β-1,4-
寡聚物，然后β-葡萄糖苷酶(纤维二糖酶)将纤维二糖水解成葡萄糖。这种理论首
次提出了纤维素酶水解纤维素是分阶段进行的概念，和水解酶难以水解高聚物结
晶区的事实相符，而且也的确在纤维素酶中分离出了和假说性能相符的、可作用
于结晶结构的C1 酶和只能水解非结晶纤维素的Cx酶，因而一度被人们普遍接受。
但是，随着研究的进行，C1-Cx 假说和许多实验事实相矛盾。如先用 C1 酶作用底物(结晶纤维素)，然后将 C1 酶和底物分开再加入 CX 酶，结果并不能使结晶纤维素水解。而且后来的事实表明，只有 3 组分共同作用才能将结晶纤维素(如棉花)水解成可溶性产物，如果将 3 组分分开，则失去水解能力。而分离的 3组分按比例混合后又可以恢复这种水解能力。因而越来越多的实验证明纤维素酶对结晶纤维素的降解是 3 组分共同作用的结果。尤其值得注意的是，研究表明C1 酶也是一种水解酶，可以作用结晶纤维素，主要产物为纤维二糖，从而证明C1 酶是一种 β-1-4 葡聚糖纤维二糖水解酶。因而实际的 C1 酶和 Cl-Cx 假说中的性能具有本质的不同。

纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌

3 藻酸盐的生物降解

藻酸盐（Alginate）是一种由海藻或是某些细菌产生的杂多糖，是由 β-D-甘露糖
致病的细菌能够产生胞外多糖形成生物膜能够粘连到宿主细胞上。肺泡纤维Yonemoto Y分离到Sphingomonassp. A聚集，然后通过细胞的内吞作用降之带入胞内。
等都能产生纤维素酶。目前研究较多的是霉菌，其中酶活力较强的菌种为木霉、曲霉、根霉和青霉，特别是里斯木霉、绿色木酶、康氏木霉等较为典型，是目前公认的较好的纤维素酶生产菌。细菌中酶活力较强的菌种有纤维粘菌属、生抱纤维粘菌属和纤维杆菌属，放线菌中有黑红旋丝放线菌、玫瑰色放线菌、纤维放线菌和白玫瑰放线菌等。

醛（β-D-mannuronate，简写 M) 和 C5 位异构的 α-L-古罗糖醛酸α-L-guluronate，简写 G）组成。这两种糖有三种随机的的排列方式，聚 β-D-甘露糖醛（MM 块），聚 α-L-古罗糖醛酸（GG 块）和杂聚块（MG 块）。来自海藻的藻酸盐由于具有金属离子的熬合能力及其溶液的粘性，被应用于食品和制药工业。

一些症（CF）病人的慢性肺部感染就是由致病菌Pseudomonas Aeruginosa能够产生藻酸盐引起。这种菌产生的高度乙酰化甘露糖醛藻酸盐在细菌和目标细胞的粘
合过程中扮演重要角色。由于生物膜的存在，是抗生素药物穿过的膜屏障。因此，治疗膜依赖性的细菌感染很是困难。对藻酸的分解可能帮助解决CF病人的气管和改善肺部气溶胶药物的给药。应用藻酸盐降解酶，可能是治疗CF病人和Pseudomonas Aeruginosa引起的其他疾病。

为了利用藻酸盐酶治疗膜依赖的疾病，Yonemoto Y分离到Sphingomonas sp. A 1能够降解藻酸盐能力。这种菌表面覆盖许多大且复杂的褶皱，细胞表面形成凹陷来吸收藻酸盐大分子。这种菌能够产生三种藻酸盐酶，A1-I，A1-II，A1-III，没有一种是分泌型的，不存在在细胞周质和培养基中，而在于胞浆中。
因此，A1被认为是直接将多糖大分子吞进细胞内的。A1-1，A1-II和A1-III由同一个前体加工而形成。A1-1自催化形成A1-II和A1-III，它们都有各自的底物特异性。A1-II对非乙酰化的藻酸盐有特异性，而A1-III特意的降解乙酰化的藻酸盐，A1-1对两者都有降解。因此A1-I被认为是一种奇特的酶，它有三个催化中心，两个藻酸盐酶中心和一个蛋白酶中心。

藻酸盐首先在细胞表面凹陷上聚集，然后通过细胞的内吞作用降之带入胞内。在革兰氏阴性菌中，对于低分子量的底物，通过具有立体选择性的内膜和没有立体选择性的外膜的转运机制很普遍。也存在对于像多糖和蛋白质之类大分子胞外分泌机制，但是目前知道的大分子吞并的模型还没有很好的弄清楚。

4 结冷胶的生物降解

结冷胶（Gellan）是一种杂多糖，由革兰氏阴性菌Sphingomonas Paicimobilis
产生，是一种线性的重复的四糖重复单元[→3)-β-D-Glcp-(1,4)-β-D-GlcAp -(1,4)-β-D-Glcp-(1,4)-α-L-Rhap-(1→]，其中以D-Glucuronyl单元的为支链的相邻的葡萄糖残基的O位被乙酰化或是甘油化。多糖的分子量约为500kD，在溶液中形成双螺旋结构。Gellan在少量（0.008%）二价正离子条件下能够形成温度不可逆变、硬且碎的凝胶体，能够耐受温度、酸和酶，在食品工业中被广泛应用为凝胶剂。

但是由于 Gellan 的高粘性，限制了有很大的限制。因此如果能够 对 Gellan的黏度进行控制，定能够扩大其应用范围，特别在食品工业。化学和酶降解被认为能够降粘。化学方法已经能够开发生产 We l a n（Gellan 相关的聚合物），酶法尚未应用于工业领域，也许因为缺乏 Gellan 降解相关酶的细节。

一种能够吸收利用Gellan的菌Bacillus sp. GL1能在Gellan 的培养基上生长，培养基的粘性快速下降。Gellan裂解酶（Gellan lyase）是一单体，分子量140kD，
能够特意将Gellan降解为四糖单元，Δ4,5-GlcAp-( l→4)-β-D-Glcp-(l→4)- α-L-Rhap-(1→3)-β-D-Glcp，表明这种酶能够降解葡萄糖与葡萄糖酸之间苷键，这种四糖最近发现是一种人类上皮细胞的生长因子。四糖被细胞吸收，由细胞内
部的不饱和葡萄糖酸酶，β-葡萄糖苷酶，α-鼠李糖苷酶继续水解，最终变成单糖。

5 黄原胶的降解研究现状

尽管黄原胶的主链结构与纤维素相同，但由于规则的螺旋结构的保护，以及侧链所产生的位阻，使得一般的糖水解酶如淀粉酶、纤维素酶和半纤维素酶等都很难将其降解，Rinaudo等在1980年第一次报道了用纤维素酶可以降解不规则构象的黄原胶主链，但却几乎完全不降解具有规则的螺旋构象的黄原胶。因此，黄原胶不能被大多数的微生物降解。为了能有效降解黄原胶，Cripps等人于1981年从土壤中分离到一种能以黄原胶为唯一碳源进行生长的棒状杆菌，随后陆续又有研究者又发现了黄原胶的降解菌株。

目前，在微生物中已知有存在两种类型的降解黄原胶的酶。一种是水解黄原胶主链的黄原胶酶（Xanthanase），但是只有少量的该酶被证实，其中的一些被归结为纤维素酶家族成员。Cadmus等分离得到了一株降解黄原胶的细菌，从其培养物得到的黄原胶酶（多种酶的混合物）能够降解黄原胶侧链的所有联接，包括乙酰甘露糖和葡萄糖主链之间的1→3糖苷键，但是对解聚多糖的能力，因为β-1,4-葡聚糖主链骨架保持完好。另一种是黄原胶裂解酶（Xanthan lyase），它能够切开侧链末端的丙酮酸化的β-D-甘露糖与β-D-葡萄糖酸之间的糖苷键。黄原胶裂解酶首先从混合培养物中获得，现在可由Bacillus和Paenibacillus纯化得到。这种酶仅能用于黄原胶的结构改造，使其具有新的物理化学性质应用于新的领域。

.

HIROKAZU NANKAI等首次阐明了黄原胶在一株细菌(Bacillus sp. Strain GL1zymatic Route for Xanthan Depolymerization by Bacillus sp)的降解途径。黄原胶首先由细菌的胞外酶黄原胶裂解酶（Xanthanlyase）切开侧链上的丙酮酸化的甘露糖与葡萄糖酸之间的糖苷键，被黄原胶裂解酶消化的黄原胶再由另一种胞外酶β-D-葡聚糖酶（β-D-glucanase）消化生成四糖物质。该四糖就是黄原胶的五糖重复单元结构再减去末端的甘露糖残基。生成的四糖可被细菌细胞吸收，被胞内的葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase）切下一分子葡萄糖转化为三糖（不饱和葡萄糖酸-乙酰甘露糖-葡萄糖）。然后三糖被不饱和葡萄糖酸水解酶（unsaturated glucuronyl hydrolase）转化生成不饱和葡萄糖酸和双糖（甘露糖-葡萄糖）。最后双糖被甘露糖苷酶（β-D-mannosidase）水解为葡萄糖和甘露糖。

6 瓜尔胶的生物降解研究现状

瓜尔胶主要成分为半乳甘露聚糖，其结构的主链是以β-1，4糖苷键相连的甘露聚糖，支链是以α-1，6糖苷键连接的半乳聚糖，半乳甘露聚糖酶具有催化此类糖苷键断裂形成小分子糖的能力。产生β-1，4甘露聚糖酶的菌自然界中发现许多。

7 多糖水解酶的开发现状

虽然一些水解酶，例如纤维素酶、木聚糖酶、壳聚糖酶，可以被微生物高效的生产。然而这些多糖水解酶的高成本、低产量、低活性和短寿命限制了它的利用。为了充分利用多糖资源，已经开始应用基因工程和蛋白质工程对酶的一些不利性质加以改造。另外，酶的 X 晶体结构分析也开始应用于对酶的结构改造研究。

对多糖降解酶的降解机理研究是应用微生物学长期而且重要的热点。对这些物质的降解微生物多种多样，包括真菌和细菌，厌氧和好氧的、嗜温的和嗜热的微生物等等。筛选和分子结构分析具有高效的酶。然而，大多数酶应用于植物多糖的降解，能够降解微生物多糖的酶在很多领域使用受限。这有可能是这方面的酶较为缺乏的缘故，多糖降解酶将是以后的重点。