一种从代谢工程酿酒酵母中生产倍半酮的方法

欣贝莱生物

Zerumbone是红球姜的主要倍半萜类成分，具有多种药理特性。在这项研究中，通过从Z.zerumbet引入α-胡萝卜素合成酶（ZSS1），α-胡萝卜素8-羟化酶（CYP71BA1）和zerumbone合酶变体（ZSD1 S114A），以及与来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AtCPR1一起进入酵母菌株，在代谢工程酵母细胞工厂中实现了从头生产zerumbone。该实验应用多步代谢工程策略，包括甲羟戊酸（MVA）途径限速酶tHMG1和ERG20的过表达，通过诱导型启动子调节ERG9和竞争途径缺失以将代谢通量重定向至所需产物。

倍半萜类化合物是萜类化合物的最大亚类，含有多种药学上有用的化合物。Zerumbone是一种单环倍半萜酮，由一种叫红球姜的植物中分离所得。最近，由于其潜在的抗炎和抗癌作用，该化合物引起了很多关注，在肥胖预防和治疗中还具有非常可观的潜在应用。Z. zerumbet是一种药用植物，其根茎是最常用于治疗腹泻，胃痉挛，发烧，炎症，细菌感染和胃肠胀气的药物。从根茎中分离出的精油被认为含有活性成分;85.81％的化合物是倍半萜类化合物，其中zerumbone是48.13％的主要化合物。

在这个研究中，构建一种倍半萜类微生物细胞工厂以生产zerumbone。实施多步代谢工程策略以增加倍半萜产量。在5升放大的发酵中，最终菌株LW16可以产生40mg/L的zerumbone。

图1.酿酒酵母中zerumbone生产的示意图。

材料和方法

培养条件

将大肠杆菌trans-T1用于质粒构建，并在含有100μg/ mL氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中于37℃培养。SC培养基（0.67％YNB，2％葡萄糖和适当的氨基酸脱落混合物）用于酵母菌株选择。当酵母菌株含有质粒Pxp320-Hum时，SC培养基也可用于摇瓶培养。 当ZSS1基因整合到基因组中时，酵母菌株在YPD（2％葡萄糖，1％酵母提取物和2％蛋白胨）中培养。

对于摇瓶发酵，从SC板中挑选单个克隆，接种到2ml培养基中，生长12h。随后，将培养物稀释到新的250mL摇瓶中，该摇瓶含有30ml初始OD600为0.5的培养基。10小时后，通过向250mL烧瓶中加入2mL十二烷引发两相摇瓶发酵，在30℃，220rpm条件下培养5天，用于发酵的所有酵母菌株。

代谢物提取和分析

通过生物分析仪测定培养基中葡萄糖和乙醇的浓度，OD600通过分光光度计测量。

对于humulene，OHum和zerumbone的分析：将2mL发酵液以10000×g离心10分钟;收集并破坏细胞，并且用乙酸乙酯提取细胞内代谢物。上清液也用乙酸乙酯萃取，并且对于两相发酵，十二烷相直接用于GC或GC-MS分析。使用配备有5975C插入物143 XL EI/CI MSD检测器的Agilent Technologies 7890A GC系统和DB-WAX柱（30 m±0.32 mm×0.25μm）进行倍半萜类化合物分析;在250℃下以分流模式（1:24）注入1μL十二烷，并以1mL/min氮气作为载气施加以下温度梯度程序：80℃3分钟，15℃/min 至180℃，180℃下0分钟，10℃/分钟至240℃，以及240℃下1分钟。检测器温度为250℃。

在5L生物反应器中批量和补料分批放大发酵

菌株LW16用于分批和补料分批发酵。将从SC平板中挑取的单个克隆在2mL YPD培养基中培养12小时，并将培养物接种到含有100mL YPD的500mL摇瓶中培养16小时。该培养物用作5-L放大发酵的种子培养基。对于分批发酵，使用2.5L YPD培养基作为工作体积，使用2L用于补料分批发酵。根据需要，通过添加5N硫酸和氨水将pH维持在5.5。发酵温度保持在30℃，空气流速为2vvm。通过将搅拌速度控制在300至600rpm，将溶解氧（DO）保持在30％以上，在培养12小时后加入10％十二烷。

对于补料分批发酵，通过控制pH和DO自动添加混合进料溶液。当DO高于50％且pH高于5.5时，进料溶液以2mL/min的速率进料，当pH降至5.5以下时自动加入氨水。补料培养基的配制（每升）：葡萄糖，500克;磷酸二氢钾,9g;硫酸钾,3.5g;硫酸钠,0.28g;七水合硫酸镁，5.12g;10 mL微量元素储备液和12毫升维生素储备液。