基于CRISPR基因编辑技术的蓝藻代谢工程

欣贝莱生物

光合微生物是生物合成化工产品的理想底盘生物，因为它们可以通过光合作用直接利用阳光、水分、二氧化碳等来合成我们所需要的一些化工产品，相比传统的化工合成，更加环保和高效。蓝藻（也常称作蓝细菌）作为最常见的一种光合微生物，因其简单、成熟的基因编辑体系，被科学家们常用来做“光合细胞工厂”的研究，在过去的十几年中，已经通过改造蓝藻成功合成了如乙醇、丙醇、丁醇、烯烃、烷烃、脂肪酸等许多重要化工产品。最近，随着最新一代基因编辑技术CRISPR不断的在大肠杆菌、酵母、高等动植物中得到突破和进展，许多科学家们也开始关注CRISPR技术在蓝藻细胞中的研究，以期望使蓝藻的合成生物学能有更大的突破和进展。

图1.单细胞（左）和丝状（右）蓝藻的细胞特征

1. CRISPR技术提高了蓝藻基因组编辑的效率

在蓝藻中，进行基因编辑操作是件非常耗时的事情，并且由于某些蓝藻是二倍体或多倍体这一特征而进一步复杂化。例如，Synechocystis sp. PCC 6803蓝藻的每个细胞可以携带多达53个染色体拷贝，而Synechococcus elongatus PCC 7942每个细胞可以包含两个拷贝。为了在二倍体或多倍体菌株中产生纯合突变体，一般需要通过多轮抗生素筛选培养，进行多次分离纯化程序以确保转化体中的所有染色体拷贝携带修饰DNA的相同序列，这可能需要数周才能完成。而使用CRISPR技术则能大大缩短了蓝藻基因编辑的过程。据研究报导，在蓝藻细胞中使用CRISPR基因编辑技术，只用经过三轮筛选，就能在一周内就能获得完全纯合突变体蓝藻。（图2为蓝藻的CRISPR操作：A、三种现在主要使用的CRISPR基因编辑系统CRISPR / Cas9、CRISPR / Cas12a、CRISPR / Cas13a的基因结构特点；B、应用CRISPR / Cas12a系统编辑蓝细菌基因组，成功获得无标记的nblA缺失突变体Synechococcus elongatus UTEX 2973）。

  

图2.蓝藻的CRISPR操作

2. CRISPR / Cas9可用于蓝藻代谢工程

通过验证CRISPR / Cas9其在蓝藻中的有效性，Li（2004）将CRISPR / Cas9应用于蓝藻生物生产琥珀酸盐，琥珀酸盐是一种具有多种工业应用的大宗化学品。为了使碳从糖原转向琥珀酸，使用CRISPR / Cas9删除编码糖原合成必需的葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶glgC基因。与野生型相比，glgC缺失突变体产生更高水平的琥珀酸（0.18mg/L），明确地证明了基于CRISPR的方法用于蓝藻代谢工程的可行性。除了基因组编辑效率的提高之外，使用CRISPR / Cas9在蓝藻中进行基因组编辑还有其他实际优势。例如，伴随CRISPR使用的同源DNA片段只需短至400bp就足以进行同源重组，并且与700bp的同源片段一样有效。而通常同源序列需要长达1000bp以确保足够的重组效率，这样不仅缩短PCR过程，同时较短的同源序列开辟了将基因整合到较小基因组靶位点内的可能性，从而大大避免了可能显著改变宿主行为和表型的不需要的重组事件的风险。

3. CRISPR/Cas12a是一种用于蓝藻工程的兼容CRISPR系统

在Wendt（2016）和Li（2016）的CRISPR / Cas9在蓝藻的相关研究中，观察到Cas9的高表达水平是有细胞毒性的，导致S.elongatus UTEX 2973和PCC 7942细胞的活力降低，这种现象也经常在真核生物观察到。这促使Pakrasi（2016）探索CRISPR/Cas12a（以前称为Cpf1）体系在蓝藻的基因组编辑研究。该研究使用CRISPR/Cas12a体系在S.elongatus UTEX 2973进行nblA基因的敲除和psbA基因的定点突变研究，同时也研究黄色荧光蛋白（eYFP）的敲入来验证转录活性。在所有情况下，大约20％的细胞被正确编辑，并且蓝藻没有表现明显的不良反应和细胞毒性现象。该体系也在 Synechocystis sp. PCC 6803 和Anabaena sp. PCC 7120这两种蓝藻中取得了类似的结果，证明CRISPR/Cas12a也可以用于蓝藻的基因编辑。

4. 蓝藻中的基因表达可以被dCas9下调

完全敲除或敲入基因有时会损害宿主生物的生存能力，并且一些蓝藻物种多倍体状态可能使得获得纯合的敲除突变体变得异常困难，同时与高Cas9诱导相关的细胞毒性使得基因编辑操作的问题更加复杂。在这些情况下，科学家们又研究了蓝藻的CRISPR干扰技术。CRISPR干扰（CRISPRi）不是利用CRISPR的基因编辑作用，而是以可使酶反应失活的dead Cas9（dCas9）来抑制基因的表达，这对于不能被删除只能降低表达量的必需基因尤其重要。Yao（2016）使用GFP作为报告基因首次在 Synechocystis sp. PCC 6803中证明了CRISPRi的效果。该研究将一组单链指导RNA（sgRNA）同时插入slr2030-slr2031这些中性位点上，发现使用无水四环素（aTc）诱导型启动子实现了多达94％的GFP抑制，并且这种抑制在去除诱导物aTc后是可逆的。CRISPRi而非Cas9依赖性基因组编辑为蓝藻的代谢工程提供了更实用的方法，可以通过竞争的代谢途径抑制以减少碳通量流失，增加所需代谢途径的更大碳通量来提高目标化学品的产量。

5．通过CRISPR可以无标记的进行蓝藻基因编辑

Kanno（2017）分别评估了多达6种天然蓝藻基因，以增强碳通量，从而提高2,3-丁二醇的合成效率。他们通过对基因组进行迭代修饰来实现这一目标，这一过程取决于无标记技术的使用。用于产生蓝藻的无标记突变体的常规方法是费力且耗时的，因为细胞选择或反选择所需的标记基因需要首先插入然后从宿主生物中除去。相比之下， CRISPR技术不需要基于细胞活力的任何选择或反选择基因。CRISPR的切割特异性允许具有正确修饰的基因组的细胞保持活力，而具有未修饰或部分修饰的基因组的细胞由于双链断裂的致死性而变得不可存活。这种简化的选择过程意味着无标记的蓝藻突变体可以在短短一周内获得。

6.总结

到目前为止，CRISPR技术已应用于工程化蓝藻Synechocystis sp. PCC6803、Synechococcus elongatus PCC7942、S.elongatus UTEX2973、Anabaena sp. PCC7120。与传统策略相比，基于CRISPR的基因改造具有多种益处。首先，可以不用选择标记基因，因为基于细胞活力的选择压力是CRISPR方法的组成部分。因此，基于CRISPR的编辑允许产生无标记敲除和敲入，从而开启以多重方式引入或缺失同时多个基因的可能性。其次，避免使用选择标记基因使得耗时的下游筛选过程减少。第三，使用CRISPRi，可以微调代谢途径并减少细胞对不需要的副产物的通量，而不会严重影响细胞活力。

对各种CRISPR机制和系统的更多了解和研究无疑将有助于科学家们开发更先进的方法来工程化生物宿主，例如蓝藻。考虑到CRISPR基因编辑技术在代谢工程中强大的应用前景，对更多微生物中的各种天然CRISPR系统的机制和理论研究将是未来生物学家们的关注重点。只有对CRISPR的了解更加深入透彻，科学家们才能开发更加完善、强大的CRISPR工具，有助于推动更多创新技术和策略，不仅用于蓝藻，还包括其他各种生物技术相关工程代谢改造。

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