人工蛋白质支架系统（AProSS）：优化酿酒酵母中外源代谢途径的有效方法

欣贝莱生物

天然产物的微生物生产已经通过将产物特异性酶或整个代谢途径引入易于改造的生物体如大肠杆菌和芽殖酵母中来实现，现在可以从代谢工程中产生的化学品范围已经大大扩展[1] 。虽然近年来代谢工程相关领域的进步十分显著，然而，将代谢途径引入异源宿主任存在很多问题。合成代谢途径往往缺乏内源性调节成分。因此，这些途径的引入经常导致生长迟缓并且由于过量表达的蛋白质，终产物和中间体的积累而导致代谢失衡，这些蛋白质，终产物和中间体通常是有毒的[2]。此外，代谢途径的不平衡通常会引起中枢代谢的应激反应[3]。目前，改变细胞内监管环境的工具仍然不太成熟。这使得通路平衡成为代谢工程中最具挑战性的问题之一。

平衡代谢途径的主要目的是通过减少宿主生物中潜在的通量不平衡和细胞负荷来产生更多的目标产物。这主要是通过消除过量中间代谢物和前体的产生来实现的，这导致中间体，底物和辅助因子有效转化成所需产物[4]。在几种成功的通路平衡方法中，翻译后的调节是通过利用合成支架来募集感兴趣途径的代谢酶以形成合成复合物并增加底物的空间取向。这可以通过酶级联的蛋白质融合来实现或合成支架，使用DNA，RNA或蛋白质将酶对接在一起[5]。 Dueber[6]证明通过引入合成支架蛋白，可以显着改善终产物甲羟戊酸的产生。他们组装了具有三个蛋白质结构域的合成支架，来自大鼠N-WASP的GBD ，来自小鼠Crk的SH3和来自小鼠α-syntrophin的PDZ。同时，他们将甲羟戊酸途径中三种酶的相应配体融合，即AtoB，HMGS和HMGR。。通过改变支架上每个结构域的数量，他们成功地找到了最佳组合并将甲羟戊酸产量提高了77倍。

支架蛋白通过协调多种酶，受体或离子通道影响细胞信号传导，并可定制以提高生化反应的效率通过将相关的酶物理定位在一起 然而，适用结构域的数量仍然很少，并且具有最佳结构域比例的支架蛋白的构建可能是繁琐且耗时的。在这项研究中，我们概述了一种模块化设计，使用蛋白质相互作用域快速的组装支架蛋白质，这些蛋白质相互作 我们生成了多个蛋白质相互作用域和配体，用于制造人工支架蛋白。与此同时，我们开发了一个强大的基于Golden-Gate的分子工具包，用于构建人工支架蛋白，允许区域类型，数量和位置的变化。通过酵母双杂交证实合成的结构域 - 配体相互作用和 split-GFP 测定。使用合成支架，我们证明两种目标产品的产量分别增加了29％和63％。此外，我们证明合成支架可用于重新连接代谢通量。我们的系统可以成为代谢工程及其他方面的有用工具。

在这项研究中，我们设计了一个标准化的装配协议，并构建了一套基于金门的分子部件，我们将其命名为人工蛋白质支架系统（AProSS ）。我们设计并构建了一个分层的三步组装系统，将任何蛋白质结构域与可变重复序列整合到支架蛋白中。另一方面，我们通过结构研究搜索并发现了三个强相互作用蛋白结构域及其相应的配体。这三个域名称为FE，YAP和BIR。FE和YAP是人FE65的两个WW结构域和YAP65蛋白，BIR是凋亡抑制蛋白（IAP）的蛋白结构域。我们选择这些蛋白质的相互作用中心并从头合成该基因，随后将蛋白质结构域与三个先前验证的结构域（即GBD，SH3和PDZ）一起模块化为标准化文库。通过酵母双杂交和分裂GFP测定验证结构域 - 配体相互作用。用AProSS 构建支架蛋白分别使紫罗兰素和脱氧紫杉醇的产量分别增加29％和63％，而重新涂覆的助焊剂使紫罗兰素和脱氧紫杉素的比率增加18％。

为了用AProSS组装人工支架蛋白，我们只需要获得没有终止密码子的蛋白质结构域的蛋白质编码序列，并通过PCR或直接合成侧接两个Bsa I识别位点。然后将该序列克隆到pMV载体中。随后可将pMV上的蛋白质结构域指定到支架蛋白上的任何指定位置并克隆到相应的pLV载体中。通过将相同的域放入几个连续的pLV中，我们可以在支架上实现可变数量的域重复。通过在金门组装方案之后将所有pLV与一个相应的pAV载体混合来组装支架的全长开放阅读框架。对于酵母表达，可以通过YeastFab方法将组装的支架克隆到转录单位（TU）中，使用选择的启动子和终止子[7]在酿酒酵母中使用。

通过支架平衡通路不利用减少过量产生的RNA或蛋白质的产生，而是通过提高底物从酶转移到酶的效率，在底物与酶反应之前使扩散最小化。基于支架的优化技术受益于细胞质中代谢物浓度极高的微区域的形成。这意味着在酶扩散是整个生产的限制步骤之一的途径中，基于支架的方法可以与所有途径正交应用，以提供对途径平衡的显着改善。

本研究中的AProSS 系统显示了构建多组分融合蛋白的巨大潜力。它不仅可以构建简单的融合蛋白，例如his标签标记的酶，而且还能够组装具有超过十种不同组分的大支架蛋白，同时确保每个部分的位置。该系统肯定会在许多进一步的研究中简化人工支架蛋白的应用。从现在开始，我们不再局限于现有的支架，而是能够设计任何合适的支架。此外，可用域扩展到六个，并可能在未来扩展到更复杂的情况。同时， AProSS该系统可应用于任何蛋白质融合情况，如标记，酶融合等。它极大地简化了克隆过程，使研究人员能够在一周内获得目标融合蛋白。

随着域库扩展，构建人工蛋白支架以调节代谢途径可以应用于原核生物和真核生物系统中的越来越复杂的情况，这要归功于AProSS 系统。该方法的标准，方便的装配操作将大大减少代工工程师的工作量。同时，组装任何结构域组合的容易性为研究人员提供了一种简单的方法来调节翻译后的途径水平也可能减少基本应变施工的工作。遵循潜在的最佳菌种选择方法：支架池构建选择，我们可以获得更高产量的产品，同时了解某些途径的科学原理。这些优势将使AProSS成为未来代谢途径调控的有用工具。

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