生产异戊二烯的工程微生物

欣贝莱生物

异戊二烯（C5H8），也被称为2-甲基-1,3-丁二烯，具有较宽范围的工业应用，范围从合成橡胶是轮胎生产中使用的粘合剂和涂料，也有被开发的潜在的燃料添加剂，柴油或喷气燃料。由于其广泛的工业应用，正面临日益增长的全球市场。目前工业生产异戊二烯几乎完全是以石油为基础的，受C5供应的萎缩影响，而异戊二烯的自然排放主要是由植物提供的。

异戊二烯是由真核生物和原核生物（包括人类、植物、酵母和细菌）产生的，占所有生物源类异戊二烯排放的40%。在所有生物体中，一年中异戊二烯的排放量最大是由植物产生的，每年大约达到6亿公吨。异戊二烯在许多草本、落叶和木本植物的叶绿体中自然合成，并在热胁迫诱导的过程中从叶片中释放出来。早在20世纪50年代就已经描述了植物的异戊二烯排放，而负责这一过程异戊二烯合酶（ISPS）的酶的分离和鉴定始于40年后。

异戊二烯合酶的结构信息、催化机理与工程

蛋白质工程可以提供已知的异戊二烯合酶的差动力学和次优稳定性的解决方案，希望获得能够在培养条件下产生高异戊二烯产率的令人满意的酶。2012年底，通过与底物类似物和动力学测量的探索，ISP在二磷酸氢二甲酯催化脱除DAPP生成异戊二烯的反应机理中，通过类似的酶结合烯丙基阳离子中间体揭示了逐步反应机理。从氘化DMAPS作为底物的反应产物中，推断了在ISPS催化过程中2-甲基-3-烯丙基-2-二磷酸的中间体。其他研究表明，苯丙氨酸在ISPS的活性位点中起重要作用，例如减少活性位点的相对大小，使活性位点富含π电子。

对ISPS结构的深入研究启发了蛋白质工程研究向更优越的动力学参数和其他性质发展，现有的ISPS可被修饰，或不自然产生异戊二烯的相关酶可通过单氨基酸变化或基于π电子的氨基酸突变转化为异戊二烯形成酶。基于氨基酸的疏水性、电荷、保守性和定位，通过DAPP的毒性缓解，显示出异戊二烯形成活性增加的突变体表现为更好的细胞生长。除了已知的ISPS工程之外，发现能够从基因数据库或自然环境中转化DMPAP-异戊二烯的新酶可能是获得具有理想特征的异戊二烯合酶的另一种途径。即除了植物ISPSs，还努力从微生物源中寻找ISPS。用13C和2H标记方法和条件敲除菌株了解枯草芽孢杆菌异戊二烯的代谢来源，通过MEP途径证实异戊二烯的形成。

生物异戊二烯生产的微生物代谢工程

无论底盘有机体的种类，生物基化学品的生产菌株的开发通常涉及以下一个或多个：

（1）通路构建：引入异源途径或工程内生途径来构建目标生物合成途径；

（2）蛋白质工程：工程、设计和发现关键酶，以去除生物合成途径中的限速步骤；

（3）阻遏：下调或删除竞争途径中的关键酶，以减少或消除碳流损失；

（4）平衡：与工程相关的代谢途径，以建立所需的能量和辅因子平衡，以及实现平衡供应和转化的关键中间体。

异戊二烯通过非天然代谢途径生物合成              

异戊烯二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）是合成异戊二烯和其他类异戊二烯如甾醇类、类胡萝卜素和多萜类化合物的通用前体。到目前为止，已经发现了两种截然不同且独立的萜类生物合成途径，即甲羟戊酸（MVA）途径和甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径[也称为1-脱氧-D-木糖-5-磷酸（DXP）途径]。

除了改善天然类异戊二烯前体途径的工程努力外，工业集团一直在追求非天然存在的异戊二烯生产代谢途径的开发，旨在解决MEP和MVA途径中存在的缺陷。考虑到细胞代谢的复杂性，特别是靶途径和共享相同中间体的其他代谢途径之间的相互作用，利用无细胞系统构建体外生化途径可能是生物合成的另一种途径。在体外合成完整的MVA通路，在异戊二烯生产中成功地从磷酸烯醇丙酮酸中得到100%的摩尔产率，稳定的产率为14.6毫克/升/小时。

为了进一步改进异戊二烯的生产，提高限制酶催化活性的限速酶的蛋白质工程也是一种潜在有效的策略。异戊二烯合酶是直接或间接参与异戊二烯生物合成的几十种酶，由于天然蛋白质的高Km和低KCAT值，是最重要的降解酶。除了通过增强途径酶的催化性能来消除可能的代谢瓶颈之外，如何指导尽可能多的目标产物的通量，同时维持代谢中间体的平衡利用是改善生物合成的另一个关键问题。

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