一种高效的一步无标记整合多拷贝染色体的方法

欣贝莱生物

酿酒酵母由于自身对恶劣环境条件的耐受性、遗传易处理性和工业使用的悠久历史，在生产方面极具优势。此外，它也被认为是用于生产食品和保健产品的安全生物体。因此，酿酒酵母广泛用于生产燃料，药物和其他高附加值化学品，这也促进了用于酿酒酵母代谢工程的新分子生物学和基因组编辑工具的广泛研究。

尽管酿酒酵母中存在高效的重组机制，但传统的基于同源重组的方法通常受到低效率的困扰。整合效率和整合拷贝数随着整合供体DNA的大小而迅速下降，限制了这种方法用于整合大型生化途径的效用。已经发现，当染色体中产生靶向双链断裂（DSB）时，重组效率显着增加。

最近，一些研究小组已经研究了可靶向核酸内切酶的使用，例如使用CRISPR技术在酵母中产生特定的DSB。这些核酸内切酶提供了更大的灵活性，并且几乎可以靶向任何DNA序列。虽然使用TALEN和CRISPR-Cas的DSB的产生显着提高了整合效率，但是这些研究中的大多数仅研究了点突变的产生或单基因的整合。然而，多个途径基因拷贝的同时整合仍然未经检验。因此，迫切需要一个方便的平台来实现高效率的多复制大型生化途径的整合。

在这项研究中，科学家们的目标是开发一种新的方法，用于将大途径多拷贝整合到酵母基因组中。为此平台设定的要求包括多副本，高效率，一步到位，理想情况下，无标记集成。 为了实现这一目标，科学家们利用CRISPR-Cas系统在酿酒酵母的染色体中的delta位点特异性地产生DSB，以增加同源重组效率。这种名为Di-CRISPR（delta integration CRISPR-Cas）的方法实现了单步，多拷贝和无标记整合DNA构建体的目标，范围从8 kb到24 kb，具有效率高的特点。为了证明该系统可以轻松应用于代谢工程应用，科学家们使用这个新型Di-CRISPR平台整合了木糖利用和（R，R）-2,3-丁二醇（BDO）生产途径的多个拷贝。木糖是木质纤维素水解产物的第二主要成分，由于其丰富和低成本已经成为一种有吸引力的原料，而BDO是一种具有广泛工业应用的重要化学品。使用这个平台，科学家们能够在一个步骤中获得能够从木糖生产BDO的菌株。 凭借Di-CRISPR平台的高效率和简单性，科学家们设想该平台对于酿酒酵母中的代谢工程和合成生物学研究非常有用。

代谢工程需要引入多酶途径和相关基因的稳定表达。同时，整合多个途径基因拷贝十分具有挑战性。在这里科学家们演示了Di-CRISPR系统，用一种简便的方法达到目的。凭借这个技术的易操作性，无标记基因组整合的实用性和无与伦比的效率和功效，科学家们设想Di-CRISPR将成为酿酒酵母基因组编辑新工具，并最终提供高拷贝的稳定替代品。

参考文献：A highly efficient single-step, markerless strategy for multi-copy chromosomal integration of large biochemical              pathways in Saccharomyces cerevisiae