光合细菌蓝藻的基因工具探讨

欣贝莱生物

蓝藻是一种能产生光合作用的微生物，又称“光合蓝细菌”，一般是研究地球上光合作用和元素循环的重要模式生物。由于能够吸收阳光并利用二氧化碳进行放氧光合作用，蓝藻也被许多科学家视作一种具有广大应用前景的 “微生物细胞工厂”，并且通过对蓝藻合成生物学的不断研究，已经成功开发出了仅以CO2和水为原料的20多种燃料和化工产品的蓝藻合成途径。然而相比大肠杆菌和酿酒酵母这两种目前普遍使用的合成生物学底盘微生物，蓝藻因其缺乏丰富高效的可用于从单个基因、代谢途径到全基因组水平的遗传操作工具，极大地限制了这种再生系统的基础生物学研究以及进一步开发和应用。但随着基因工具在调节基因表达、碳通量重新定向以及全基因组操作方面的重要性已在蓝藻合成生物学研究中得到越来越多的认可与关注，蓝藻相关的基因工具的研究在近些年来取得了许多重大进展和突破。

即使近年来关于基因工具的研究取得了很大进展，但由于大多数遗传工具尚未建立起规范，像适用于大肠杆菌的生物砖标准库就不适用于蓝藻。此外，生物学家进行FBA分析的困难限制了基因组规模分析的应用。为了解决这些问题，未来可能需要更多关注以下方面：

（1）应用高通量筛选方法开发遗传工具

与快速增长的微生物如大肠杆菌相比，蓝藻突变体的成功构建通常需要一个月或更长时间。因此，常见的试验和错误策略（即基于启动子或RBS文库的随机筛选）对于蓝藻是不实际的。高通量筛选方法对于加速建立蓝藻工具箱数据库是必要的。为实现这一目标，几种基于单细胞筛选的策略在未来可能会有用。2006年初，在Synechocystis 6803中开发了基于流式细胞术的聚-3-羟基丁酸酯的高通量筛选。最近，通过基于液滴的单细胞筛选开发了另一种用于鉴定基因工程产生的Synechocystis 6803的L-乳酸菌株的高通量方法。在这种方法中，来自UV诱导的文库的每个突变体被封装在液滴中，然后在液滴内产生L-乳酸并通过皮下注射器通过乳酸测定检测捕获的荧光。

（2）转录调节和自我切割介导的核糖开关的发展

发展转录调节核糖开关的一个重要动机是它们可以为蛋白编码基因和非编码RNA提供表达控制的可能性。通过将茶碱感应适体与间隔元件融合，然后与适配子互补序列融合，转录调节核糖开关已在大肠杆菌中表现出功能。类似地，蓝藻中的翻译调控茶碱感受核糖开关也可以被修改以在转录水平上起作用。此外，转录调控核糖开关可通过控制crRNA / tracrRNA或sgRNA等，与CRISPR / Cas系统等其他遗传工具配合使用。

（3）基于本地CRISPR / Cas系统的新基因组编辑工具的开发和优化

早在2013年，多达126个蓝藻基因组通过生物信息学分析内在的天然CRISPR / CAS系统，结果表明，除了海水蓝藻（Synechococcus 和Prochlorococcus），其中大部分都具有内源的CRISPR / Cas系统。虽然目前一些关于蓝藻CRISPR / Cas系统的研究主要集中在内源性CRISPR / Cas相关基因的功能阐明上，但这些结果将为基于天然蓝细菌CRISPR / Cas系统开发基因工具的可行性大大提高。

（4）转录调节和自我切割介导的核糖开关的发展

到目前为止，所有可用的sRNA调控工具都是在靶基因的敲低表达中起作用。尽管大多数细菌sRNA通过抑制靶mRNA而发挥功能，但先前也报道了可激活mRNA的sRNA，例如梭菌的VR-RNA和链球菌的FasX。同时，为了激活翻译，最近开发了RNA-IN / OUT系统，其中具有“IN”序列与靶mRNA结合形成隔离Shine Dalgarno序列的mRNA，但通过“OUT”序列释放该隔离结构。类似的遗传工具可以用于增强蓝藻中基因的表达。

（5）开发用于基因组模型分析的工具

FBA对代谢工程和基础研究来说都是一个非常有用的工具。然而，只有有限的研究在实验研究中应用了FBA。这个问题可能部分归因于当前模型的不完善，因为蓝藻基因组中许多未知和假设的基因仍未被阐明，以及缺乏一些实用的工具，如可编辑的在线工具，供研究人员执行基于约束的基因组比例模型分析。建立可轻松用于基因组模型分析并基于实验数据逐步优化的可编辑工具将显着促进蓝藻的应用和基础研究。