VAO酶的特性及应用

欣贝莱生物

香草醇氧化酶（VAO）是黄素依赖性酶，催化对位取代苯酚的氧化。这个酶能够将木质素衍生的芳族单体转化为有价值的化合物，从而成为潜在的有趣的生物催化剂。这类氧化性黄素酶在生物技术上的应用（其应用范围从作为生物催化剂用于合成药物化合物再到整合于生物传感器）引起研究人员的广泛关注。本文综述了近年来VAO酶领域的研究进展和以及获得的关于这些酶的生化知识。

VAO酶来自真菌Penicillium simplicissimum，是由560个氨基酸（64 kDa）组成的蛋白质。香草醇氧化酶（VAO；EC1.1.3.38）型氧化酶，属于黄素蛋白酶家族。木质素是木质纤维素生物质的主要成分之一，它是一种异质芳香聚合物，由单木脂醇对香豆醇，松柏醇和芥子醇通过自由基偶联过程形成。它是在生物精炼厂处理植物生物质期间作为副产品获得的，是芳香化合物合成与应用中最有吸引力的可再生原料。为了利用木质素作为可再生化学原料的全部潜力，我们期望开发新的方法将其解聚成单体芳族化合物，并随后将它们转化为增值化合物。而木质素衍生的芳香族分子转化成增值化合物的最有利的方式是通过氧化酶的作用。VAO是催化苯酚的对位取代，其取代基C位的双电子氧化，分子氧充当反应的电子受体，从而转化为过氧化氢。VAO具有广泛的底物特异性，催化醇氧化成醛，胺的氧化脱氨，醚的氧化脱甲基化，烷基的脱氢或羟基化和烯丙基的羟基化。而VAO的结构在低聚态时，其主要是八聚体溶液，在某些特殊条件下也可能存在活性二聚体。

  1.VAO氧化酶的结构特征

与GMC型黄素蛋白类似，所有VAOα型黄素蛋白在蛋白质的N-末端都含有不同的FAD结合结构域（FAD结合结构域，Pfam01565）（图一），该结构域包括所谓的PP环。香草醇氧化酶晶体结构首次揭示了FAD辅因子通过组氨酸残基共价连接至蛋白质。其中FAD的焦磷酸部分与蛋白质相互作用。VAO黄素蛋白家族富含共价黄素蛋白（估计25％含有组氨酰-FAD）。同时，有文章证实，通过将FAD辅因子共价连接至组氨酸，辅因子的还原电位增加。因此，可行的电子受体的数量是有限的，分子氧成为少数候选人之一，而这解释了为什么许多VAO黄蛋白充当氧化酶的功能。最近，已经发现几种VAO型氧化酶甚至含有共价连接的FAD辅因子。在这种情况下，除了组氨酰键之外，FAD也连接半胱氨酸的第6位。除了对氧化还原电位的影响之外，第二个共价键允许蛋白质产生非常开放的活性位点，同时通过双价锚定将FAD辅因子保留在催化位置。这与所描述的双价黄素蛋白氧化酶都接受相当庞大的底物的观察结果一致。.而在溶液中，VAO通常以八聚体的低聚态出现中，其二聚体 - 二聚体界面的由残基220-235组成的环形成（图二）。

图一：单个VAO酶与FMN/FAD辅因子结合图，，其中橙黄色未FMN/FAD辅因子

图二：VAO八聚体结构的卡通表示，显示二聚体 - 二聚体相互作用环在形成二聚体 - 二聚体界面中所起的突出作用。 FAD结合结构域以绿色显示，底物结合结构域呈红色，二聚体 - 二聚体以蓝色显示相互作用环，FAD辅因子以黄色条显示。

       2.VAO氧化酶的催化特性

对于VAO型氧化酶，有关其氧反应性的一些机理已经阐明。对于VAO型胆固醇 - 三醇氧化酶和糖醇氧化酶（EC 1.1.3.41），文章已经描述了其特异性的氧通道可以将双氧引导至FAD处。而氧化酶这一类，其氧通道都位于蛋白质的C端部分，这种结构会导致活性位点上形成一个氧进入位点。基于这种发现，构建Lα半乳糖酸内酯脱氢酶（EC1.3.2.3）的突变体，结果表明在活性位点产生了这样的氧通道，证实了这种突变确实会引起氧化酶的产生。在过去十年中，有大量新型VAO型氧化酶已被发现和研究。除了醇氧化，大多数情况下，VAO可以氧化醛或酮以及许多其他化学键。VAO本身表现出醇和胺氧化，烷基酚的羟基化和醚键断裂。 VAO的另一个显着的例子是网状氧化酶，也称为柏氨酸桥联酶（EC 1.21.3.3）。该酶能够形成C-C键，在从（S）状番荔枝碱到植物生物碱（S） - 鳞蓝碱的转化中形成甲基和芳香碳之间的分子内键,文章阐明这种植物酶的晶体结构揭示了反应是由氢化物从底物转移到黄素辅因子引发的，而可以催化氧化C-C键形成的VAO型氧化酶并不受植物的限制。来自真菌Alternariaasolani的Prosolanapyrone-II氧化酶（EC1.1.3.42）可以催化进行分子内狄尔斯 - 阿尔德反应，其中被缀合的二烯与碳 - 碳双键反应的[4 + 2]环加成。

3.蛋白质表达和纯化

为了表达His-VAO酶，首先构建VAO-pet-22b载体，将整个质粒转化入大肠BL21中。可以将含有正确质粒的BL21大肠杆菌在含有100μg/ mL氨苄青霉素的100mL LB培养基中于37℃下生长至OD600为0.6。随后，通过向终浓度为0.8mM添加iPTG诱导蛋白质表达，并使细胞在15℃过夜生长。接下来，通过离心（4200×g，15分钟，4℃）收获细胞并重悬于含有500mM NaCl，5％甘油（v / v），0.5mM硫酸镁的50mM磷酸钾的pH7.5的缓冲液[15,18]50mL。通过超声处理使细胞裂解，使用MSE超声探针以最大功率30s进行6次循环。超声处理期间样品在冰上冷却。此后，通过离心（39,000×g，45分钟，4℃）除去细胞碎片，将上清液加载到含有2mL HisPurNi-NTA树脂（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）的重力流动柱上。用50mM磷酸钾，pH7.5，含有500mM NaCl和5％甘油的缓冲液洗涤柱子，直到在280nm处吸收流出物为止，此举可将所有未结合的蛋白质都洗脱出来。随后，使用含有500mM NaCl，5％甘油（v / v）和200mM咪唑的50mM磷酸钾缓冲液（pH 7.5）洗脱His-VAO。合并含有His-VAO的溶液，并将它们转移到含有150mM NaCl和10％甘油的50mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）中，使其通过平衡过的Econo-Pac 10DG脱盐柱（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）这个缓冲区。这个过程通常可以从100mL大肠杆菌培养物中产生1-3mg蛋白质。

纯化His-VAO后，由于纯化蛋白质不含有任何黄素辅因子。为了获得含黄素的蛋白质，需要将纯化的His-VAO与含有75mM NaCl、5％甘油基丙酸酯、1mM FAD的50mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）中的一起温育4小时。随后，使混合物经过在含有150mM NaCl和10％甘油的50mM磷酸钾的pH7.5的缓冲液中平衡的Econo-Pac 10DG脱盐柱（Bio-Rad）来去除游离FAD。通过测量它们的吸收光谱收集含有蛋白质的级份并分析黄素含量。

  4、结论

黄素蛋白家族中广泛存在氧化酶。这表明大自然已经找到了让还原型黄酮因子使用分子氧作为氧化剂的能力的方法。而且，令人感兴趣的是，由于蛋白质结构折叠，从而使得某些氧化反应占据优势。并且，来自不同结构家族的氧化酶可以具有相似的活性。这些氧化酶的反应包括醇氧化，胺氧化，氧化醚键断裂，羟基化和氧化C-C和C-O键的形成。此外，最近发现的含有双键结合FAD的VAO型氧化酶能够催化相对较大。同时，文章表明，通过酶工程，可以将氧通道引入黄素酶，从而使其获得氧化活性是可行的。这些例子表明，可利用的黄素蛋白氧化酶的数量正在迅速扩大，这将促进基于氧化酶的生物技术应用的发展。

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