酿酒酵母的代谢工程在不同代谢水平上的优化

欣贝莱生物

夏大阿珩

酿酒酵母是目前最常用的细胞工厂之一，被广泛设计用于从各种原料中高水平地生产各种各样的产品，而代谢工程旨在通过重新规划细胞的代谢途径来开发高效的细胞工厂。

由于对气候变化和可持续性的关注，人们越来越关注利用微生物细胞工厂将可再生资源转化为燃料和化学品。由于微生物在各种环境条件下能自我调节以维持代谢稳态，所以它们的代谢必须重新规划调控以达到用于商业生产的高滴度，速率和收率（TRY）。代谢工程是重新连接细胞代谢的科学，并且在细胞工厂开发中发现了广泛的应用，包括（1）扩展的底物范围，使酵母细胞能利用更多种类的底物; （2）增加目的产物的产量; （3）能够在酵母中生产新化合物，例如紫杉醇和阿片类药物; （4）改善的细胞特性，如耐受苛刻的工业条件。

酿酒酵母已广泛用于生物合成行业，因为它通常被认为是安全的（GRAS）状态适合于大规模操作。作为模式真核系统，目前已有充足的基因工程工具深入的研究了酿酒酵母的分子和细胞生物学。与原核生物不同，酿酒酵母具有多种细胞器，能够为生物合成提供不同的环境和隔室。此外，酿酒酵母对严苛的工业条件表现出高度的耐受性。

工程微生物的生物合成通常涉及通过代谢途径将一些前体代谢产物转化为感兴趣的产物，其中部分或全部步骤由异源酶催化。因此，代谢工程的主要目标包括通过基因工程增强前体供应和通过通路工程优化代谢途径，所以本文从几个方面简单的说明如何应用这些代谢工程方法来开发高效的酵母细胞工厂。

图2 生物合成途径在DNA，RNA，蛋白质和代谢物水平上的优化。

（A）通过不同拷贝数的质粒优化；

（B）通过不同强度的启动子优化；

（C）通过蛋白突变体组合优化；

（D）通过蛋白共定位优化；

（E）动态代谢通量控制。

DNA水平上的代谢途径优化

在酿酒酵母中，基于CEN / ARS的低拷贝（〜1-4拷贝/细胞）和基于2μ的高拷贝质粒（〜20-30拷贝/细胞）已经被广泛用于代谢工程。值得注意的是，当包含抗生素标记时，基于2μ的质粒的拷贝数可以与基于CEN / ARS的质粒一样低。因此，相对较低的质粒拷贝数（PCNs）常常成为代谢工程的瓶颈，在许多情况下需要高水平表达异源基因。有趣的是，发现PCN可以通过使用删减或部分缺陷的启动子来驱动选择标记基因（即LEU2和URA3）。在最近的一项研究中，Lian等人 系统地评估了选择标记蛋白在PCN上的表达水平的影响。构建了一系列具有逐渐增加的拷贝数的质粒，对于具有营养缺陷型和抗生素标记物的质粒高达约80拷贝/细胞。增强PCN的类似策略是通过与降解标签融合来使标志蛋白变得不稳定。具有增加和可调节拷贝数的质粒将是鉴定和解决代谢途径瓶颈的宝贵工具，预计那些具有抗生素标记的质粒可用于工业酵母菌株工程。

RNA水平上的代谢途径优化

作为基因表达的第一步，使用合适的启动子进行成功转录对代谢工程至关重要。通过使用不同强度的启动子，可以精确控制限速酶或分支点酶的表达水平。酵母启动子比它们的原核生物复杂得多，因为启动子元件是不保守的或特征不清晰。因此，酵母启动子工程研究主要基于已知的具有不同强度的组成型或诱导型启动子，如CYC1 p，ADH1 p和TEF1 p。转录控制在同时微调多个基因的表达以使产物TRY最大化方面起着重要作用。为了实现这一点，使用启动子文库来驱动每个途径基因的表达，并进一步评估所得的组合途径文库（图2 B）。启动子文库可以包含具有不同强度的不同内源启动子或启动子突变体（由易错PCR产生）。通过选择不同的启动子来实现代谢途径在转录水平上的调控。

蛋白质水平上的代谢途径优化

除了基于启动子的组合途径工程方法外，还可以通过探索具有不同性质的酶类似物的各种组合来平衡和优化多基因途径（图 2 C）。考虑到酶的多样性，基于蛋白质的组合路径工程方法可以很容易地应用于多基因通路的快速优化，为代谢工程提供一种高度定制化的方法。生物合成途径的表现也可以通过蛋白质共定位来平衡和优化（图 2 D），其可以大大增加酶和代谢物的局部浓度。另外，促进底物利用的途径和减少有毒中间体的释放是提高通路效率的其他可能的原因。最简单的方法是将代谢酶融合在一起。例如，当与单独表达的基因相比时，内源法尼基二磷酸（FPP）合酶（FPPS，ERG20）与红没药烯合酶（AgBIS）的融合使得红没药烯的产量增加2倍。Albertsen等人 将ERG20与植物广藿香醇合酶融合使得广藿香醇的产生增加约2倍。一种更灵活的蛋白质共定位方法是利用蛋白质支架，将靠近彼此的酶对接起来。Tippmann等人 报道了使用affibody作为酶共定位的蛋白质支架，它能在胞内特异性识别与其结合的特异性配体。通过在酿酒酵母中共定位FPPS和法呢烯合酶（FS），在分批补料培养中，利用葡萄糖合成法呢烯的产量提高了135%。目前还有很多对蛋白调控的方法，通过对蛋白的调控来有效的优化酿酒酵母的代谢水平。

代谢路径优化的动态通量控制

尽管上述代谢途径优化策略已广泛用于代谢工程，但静态本质使得它们在某些情况下不是最佳的。理想的通量控制应能够实时响应内部和（或者）外部条件（图2 E）。在动态通量控制系统中，途径基因（特别是通量控制基因）的表达水平取决于细胞内代谢物浓度。换句话说，通路酶只在需要时表达。因此，动态通量控制不仅可以减少代谢负担，还可以减少副产物形成。例如，HXT1启动子的强度依赖于葡萄糖浓度。在代谢工程的情况下，在发酵开始时，由于丰富的葡萄糖，细胞密度低但基因表达高; 当细胞密度变高时，葡萄糖被耗尽以抑制基因表达。因此，HXT1p可用于动态调节竞争途径基因，其表达对细胞存活至关重要，ERG9是最具代表性的例子。ERG9 （角鲨烯合成酶）的表达水平是通过内源性麦角甾醇的代谢通量的分布形成或异源萜类生物合成来调控的。Scalcinati等人。使用HXT1启动子控制ERG9的表达，将甾醇合成的碳通量转移到α-檀香萜，并将生产力提高了3.4倍。

除了糖响应启动子外，基于转录因子的生物传感器也被用于动态通量控制。David等人 开发了基于FapR的丙二酰辅酶A生物传感器来动态调节丙二酰辅酶A还原酶的表达，其显着增加了3-HP的产生。目前在酵母中开发了一种综合的群体感应系统，并结合RNA干扰(RNAi)进行动态代谢途径控制。该系统在高细胞密度下自主触发基因表达，并与RNAi模块连接以抑制靶基因的表达。

在这里，我们从这四方面简单的介绍了如何从这四个方面优化，来提高酿酒酵母细胞内的代谢途径，即使过去十年取得了重大进展，但代谢工程的努力在如今仍然取得了不同程度的成功，通过各种优化的方式重新规划细胞的代谢途径来开发高效的细胞工厂，使微生物利用各种各样的底物生产我们想要的产物变得更加便捷、经济以及高效。

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