细菌生理生化具体操作

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细菌生理生化具体操作
细菌生理生化试验  

微生物生理生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区分的微生物。因此微生物生理生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物鉴定中常用的生理生化反应如下所示：
(一) 糖、醇发酵试验
原理：
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由紫（蓝）变黄（指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为紫（蓝）色。
培养基配制：
一般细菌常用休和李夫森二氏培养基：
蛋白胨：2g ，K2HPO4 :0.2g ，NaCl:5g ，糖（醇、糖苷）：1% ，水洗琼脂：5～6g，蒸馏水：1000mL，PH:6.8～7.0，溴百里酚蓝：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。
芽孢杆菌培养基配制：
(NH4)2HPO4:1g ，MgSO4:0.2g ，KCl:0.2g ，酵母膏：0.2g ，糖（醇、糖苷）：1%水洗琼脂：5～6g ，蒸馏水：1000mL ，溴甲酚紫：0.4%乙醇液2mL，PH:6.8～7.0。先调PH后再加指示剂。
将以上培养基分装试管，培养基高度约为4～5cm ，115℃灭菌20min。
测定的糖（醇、糖苷）类可以包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。
注意：以上亦可用液体培养基。
接种和观察结果：
用18～24h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性；有气泡产生为产气。
结果记录：
产酸：+，产气：○，不产酸长气：- 。
(二) 淀粉水解试验
原理：
某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。　
培养基配制：
牛肉膏5g；NaCl:5g；可溶性淀粉5g；琼脂:20g；蒸馏水1000mL。PH:7.2
121℃灭菌20min。
试验方法：
以18~24h的纯培养物，点接于淀粉琼脂平板（一个平板可分区接种）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培养24～48h，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明圈或肉汤呈深蓝色。
　　淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。
结果记录：分解：+，不分解：-。
(三) V-P试验
原理：
菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
培养基配制方法：
蛋白胨5g；葡萄糖5g；NaCl(K2PO4):5g；蒸馏水：1000mL；PH:7.0～7.2，分装试管，毎管装约4～5cm，115℃灭菌20min。
试剂：40%NaOH(或KOH)，a-萘酚。
试验方法：
将试验菌接种于上述培养基，于36±1°C培养4天、培养液2.5ml先加入a萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2～5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。
结果记录：阳性：+，阴性：- 。
(四) 甲基红（Methyl Red）试验
原理：
有些细菌能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
培养基配制方法：
与V-P试验培养基一致。
试剂：甲基红:0.1g，95%乙醇：300mL，蒸馏水：200mL。
试验方法：
挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）3～5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1～2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阳性、即可判定结果。
结果记录：阳性：+，阴性：- 。
(五) 菌膜形成试验
有些菌在液体培养基中能形成菌膜，利用这一特征可进行不同细菌的区别。
培养基配制方法：蛋白胨：5g；氯化钠：5g；牛肉膏：10g；蒸馏水：1000mL；pH ：7.2。121℃灭菌15～30min。
试验方法：接种后于30℃培养24小时，观察培养物是否有菌膜形成，有菌膜为阳性。
(六) 明胶（Gelatin）液化试验
原理：
有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。　　
培养基配制方法：蛋白胨：5g，明胶：120g，蒸馏水：1000mL。PH:7.2～7.4，分装试管，毎管装约4～5cm，115℃灭菌20min。
试验方法：
挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。否则为阴性。
(七) 尿酶（Urease）试验
原理：
有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。
培养基配制方法：
蛋白胨：1 g ；NaCl：5 g ；KH2PO4 ：2 g ；葡萄糖 1 g ；琼脂：15 g；酚红：0.012g；蒸馏水 1000 ml。
除酚红外，溶解上述成分，并调节PH为6.8～6.9，然后加入酚红指示剂，使培养基呈橙黄色，分装，115℃灭菌20min。待培养基冷至50℃左右，加入预先过滤除菌的20%尿素水溶液，使其终浓度为2%。
试验方法：
挑取18~24h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培养1～4d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红色为阳性。
(八) 氧化酶（Oxidase）试验
原理：
氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。
试剂：
试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。
(九) 过氧化氢酶试验(触酶试验)
具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
方法：直接滴加3％过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察，有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。
(十) 精氨酸脱羧基酶试验
培养基：
        K2HPO4:         1.0g
        NH4Cl:          1.0g
        MgSO4:         0.2g
        酵母膏：       0.2g
        葡萄糖：       1.0g
        DL-精氨酸：    1.0g
        1.6%溴甲酚紫： 1mL
        H2O:           1000mL
        pH:            6.7-6.8
分装试管，115℃灭菌30min。
接种后置30℃培养24h，紫色者为阳性，呈黄色者为阳性。
(十一) 卵磷脂酶试验：
培养基：
        蛋白胨：       10g
        酵母膏：       3g
        NaCl:           5g
        琼脂：         20g
H2O:           1000mL
        pH:            7.0-7.2
分装三角瓶，121℃灭菌30min。
用75%乙醇将新鲜鸡蛋表面消毒，并用经火焰灭菌的镊子将鸡蛋打一个孔，倾去蛋清，然后用5mL无菌吸管吸出卵黄，加入到融化后冷却至50℃左右的培养基中，使卵黄含量为培养基总体积的2-3%，混匀后倒平板，点接菌种，30℃培养24h后观察，菌落边缘出现浑浊圈者为卵磷脂酶阳性。
(十二) 蛋白质水解试验：（即明胶水解试验）
培养基：
        牛肉膏：         5.0g
        蛋白胨：         1.0g
        明胶：           4.0g
        葡萄糖：         1.0g
        NaCl：           5.0g
        K2HPO4:          0.5g
        KH2PO4:          0.5g
琼脂：           20g
        H2O:             1000mL
分装三角瓶，121℃灭菌30min。
将培养基融化后倒平板，并点接菌种，30℃培养2d，用酸性升汞溶液倾注于平板表面，如果菌落周围出现透明圈，则为阳性。
(十三) 七叶苷试验（七叶灵试验）：
培养基：
       牛肉膏：        10g
       七叶灵：        5g
        琼脂：         20g
        H2O：         1000mL
        pH:            自然
分装三角瓶，121℃灭菌30min。
另配5%FeCl3水溶液，单独灭菌。培养基融化后，先将每个平板加上FeCl3溶液二滴，然后倒培养基混匀，凝固后点接菌种，30℃培养2-3d观察。菌苔周围出现深褐色区者为阳性反应。


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