一、实验目的 采用SDS-PAGE进行聚谷氨酸分子量大小的测定 二、实验材料 2.1 实验试剂 2.1.1 5×样品缓冲液:Tris-HCl 60 mmol/L,SDS 20 g/L,甘油 250 mL/L,巯基乙醇 14.4 mmol/L,溴酚兰1 g/L,pH 6.8。 考马斯亮蓝染液:将1.25 g考马斯亮蓝 R-250溶在230 mL甲醇与230 mL蒸馏水中, 搅拌1小时后加40 mL冰醋酸,过滤。 考马斯亮蓝脱色液:甲醇 300 mL,冰醋酸 100 mL,蒸馏水 600 mL。 2.2.2 电泳过程中所使用的溶液[47] A液:丙烯酰胺溶液30%(W/V),即丙烯酰胺29.2 g,甲叉双丙烯酰胺0.8 g,混合后,用蒸馏水溶解并定容至100 mL。 B液:4×分离胶缓冲液,即Tris-HCl 1.5 mol/L,SDS 4 g/L,pH 8.8。 C液:4×浓缩胶缓冲液,即Tris-HCl 0.5 mol/L,SDS 4 g/L,pH 6.8。 10%过硫酸氨:现用现配,取10 g过硫酸氨,用蒸馏水溶解并定容到100 mL。 电泳缓冲液:Tris碱 25 mmol/L,甘氨酸 192 mmol/L,SDS 1 g/L,pH 8.3。 2.2实验器材 电泳仪,电流槽 三、实验方法 3.1 将降解后的小分子聚谷氨酸配制成浓度为20 mg/mL的溶液2 mL,之后用SDS- PAGE测定分子量。所用的标准蛋白分子量依次为14.4 KDa,20.2 KDa,26.0 KDa,35.0 KDa,45.0 KDa,66.2 KDa,94.0 KDa。电泳液的配制见试剂的配制一栏,凝胶的配制 见表2。按常规方法制备。 表2 电泳凝胶的配制 Tab.2 Preparation of gel electrophoresis 组分 分离胶(12%) 浓缩胶(5%) A 液 4.0 mL 0.67 mL B 液 2.5 mL - C 液 - mL 过硫酸氨 μ μL 蒸馏水 3.5 mL 2.3 mL TEMED 5 μL 10 μL 3.2 具体操作如下: (1) 灌制分离胶 组装凝模具可按照使用说明书,装配好灌胶用的模具; 将A液、B液用蒸馏水在一个小烧瓶或试管中混合,丙烯酰胺(A液中)是神经毒素, 操作时必须使用手套; 加入过硫酸铵和TEMED后,轻轻搅拌使其混匀(过量气泡的产生会干扰聚合)。 凝胶很快会聚合,操作要迅速; 小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内,这样可以避免在凝胶内产生气泡; 当加入适量的分离胶溶液时,轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1-5 mm的水层,这使 凝胶表面变得平整; 等待30~60 min,使凝胶聚合。当凝胶聚合后,在分离胶和水层之间将会出现一个 清晰的界面,可以微微倾斜模具,检测凝胶是否聚合。另外的办法是将灌完分离胶后的 剩余的凝胶溶液置于一个小容器内,作为检测凝胶聚合的标志。如果凝胶渗漏,但还没 有覆盖水层,可以回收分离胶溶液,重新装配玻璃板和隔片,在凝胶聚合之前重新灌胶, 胶聚合后将水层吸出。 (2) 灌制浓缩胶 吸尽覆盖在分离胶上的水; 将A液、C液和蒸馏水在三角瓶中或小试管中混合; 加入过硫酸胺和TEMED,并轻轻搅拌使其混匀; 将浓缩胶溶液用吸管加至分离胶的上面,直到凝胶溶液到达前玻璃板的顶端; 将15孔的梳子插入凝胶内,直到梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确保梳 子齿的末端没有气泡。 待胶聚合后(约30 min),小心拔出梳子,不要将加样孔撕裂; 将凝胶放入电泳槽内,将电泳缓冲液加入内外电泳槽中,使凝胶的上下端均能浸泡 在缓冲液中。 (3) 制备样品和上样 样品的处理:γ-PGA样品(浓度约为20 mg/mL)与样品缓冲液按1:1的比例混合, 在100 ℃水浴处理2~5 min,Marker的处理方法相同。用微量注射器将样品加入样品孔中, 上样量为15 μL。将蛋白质样品加至样品孔的底部,并随着染料水平的升高而升高注射 器针头。避免带入气泡,气泡易使样品混入到相邻的加样孔中。 电泳条件:浓缩胶电压为120 V,进入分离胶后电压为140 V,2 h左右溴酚兰接近 胶边缘,结束电泳。 (4) 储存液[49] 标准蛋白染色:用考马斯亮蓝染色液(考马斯亮蓝R250 2.5 g/L,用甲醇:水:冰乙 酸=4.5:4.5:1配制,V/V)染色过夜。 第一次脱色:凝胶从染色液中取出,用去离子水洗两次,再用脱色液(甲醇300 mL/L, 乙酸100 mL/L)在脱色摇床上脱色过夜。 复染:凝胶从前脱色液中取出,使标准蛋白着色后,水洗两次,再用阿利新兰8GX 对凝胶复染(0.5%的阿利新兰8GX,用0.3%的冰乙酸配制),染色20 min。 固定:凝胶从染色液中取出,置于60%乙醇溶液(V/V)中在脱色摇床中摇动40 min。 第二次脱色:凝胶从染色液中取出,用去离子水洗两次,最后用去离子水置于脱色 摇床上脱色过夜,期间更换脱色液3-4次。 |