HPLC分析方法在食品中的应用

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食品分析中HPLC方法与应用
自HPLC仪问世以来，其硬件技术、分析方法及应用研究发展迅速。本文仅就在食品化学分析中，HPLC分析技术与应用展概述如下。
一、HPLC分析方法进展
● 液-固色谱法（LSC） LSC是根据组分基团对吸附剂表面亲和力的大小，决定了其保留程度。在LSC色谱中应用最广泛的极性固定相是硅胶。
● 反相色谱法（RPC） RPC是指在非极性固定相上的液相色谱法，固定相多为化学键合相。其代表为ODS。目前，某些极性键合相，如氨基键合相也广泛应用于反相色谱中。反相色谱可分离离子型和非离子型化合物。据统计，在食品化学HPLC分析中，90%以上的分析过程都是反相色谱法。
● 离子对色谱（IPC） IPC又称为离子对分配色谱，是近年来发展较快的一种色谱技术。目的是应用液-液分配色谱实现对强电解质和弱电解质混合物，或对电解质和非电离物质混合物的分离。IPC根据固定相和流动相的相对极性分为正相和反相方式，但反相IPC应用较多，如氨基酸、多肽、核酸、各种药物、有机酸的分析。
● 离子色谱法（IC） IC法是HPLC中用于分离分析离子型化合物的方法，按分离机理的不同，IC可分为高效离子交换色谱法（HPIC）、高效离子排斥色谱法（HPICE）和流动相离子色谱法（MPIC）。HPIC主要用于亲水阴、阳离子和碳水化合物的分离；HPICE多用于无机弱酸、有机酸、氨基酸、醛、醇的分离；MPIC可用于疏水性阴、阳离子和过渡金属配合物的分离。IC分析多种阴离子快速、灵敏、选择性好。目前许多国家建立了采用IC法测定水质中阴、阳离子的标准检验法；AOAC已批准四项用于食品分析的IC法。
● 反相胶束色谱法（RPMC） 在反相离子对色谱中，当反离子采用表面活性剂超过一般离子对色谱所用的浓度时（达0.02～0.2mol/L），此时的反相色谱称为RPMC。RPMC分为正反相胶束色谱。特点是具有高度的选择性，有利于梯度洗脱，提高了检测灵敏度。主要应用于血清、尿液中药物浓度测定，其优点是样品可直接进样分析，分析时间短，样液量少，准确度高。
● 空间排阻色谱法（SEC） 又称为体系排阻色谱法，是利用多孔凝胶固定相，依据分子大小差异来进行分离的方法。根据凝胶性质可分为凝胶过滤色谱法（GFC）和凝胶渗透色谱法（GPC）。SEC适用于需很快提供未知样品分子大小、组成、近似分子量信息。GFC适用于分析水溶液中多肽、蛋白质、核苷酸、多糖等；GPC主要用于高聚物的分子测定。如聚乙烯、聚氯乙烯等精细化工原料。
● 间接光度液相色谱法 间接光度液相色谱检测技术是一项正在发展中的色谱技术，在离子和离子对色谱中都有应用。该法是对于无紫外吸收的样品采用UVD来检测的方法。优点是扩大UVD的应用范围，可用于低响应或无响应的样品。多用于无机和有机阴离子的测定。。
● 化学衍生液相色谱法 它是采用衍生试剂，借助化学反应给样品组分化合物分子接上某个特殊基团，使其衍生物能够改善分离效果和提高检测灵敏度的方法。可分为柱前和柱后衍生法。衍生试剂有多种，可与胺类、氨基酸、酚、醇等发生衍生化反应。
二、HPLC检测器应用进展
(一) 检测器与应用进展
● 激光诱导荧光检测器（LIF） LIF与普通荧光检测器的主要区别是其以激光器做为光源。因此，其单色性好，谱带宽度可达10-8nm以下，使溶剂的瑞利散射光和拉曼散射光的带宽为1.0nm，因而可选择地消除对荧光性号的干扰；聚光性好，聚光点直径几微米，可减小流通池体积，适用于微型和毛细管液相色谱；具有最高的灵敏度（10-9mol/L～10-12 mol/L），对一些荧光效率高的物质可达到单分子检测。
● 电化学检测器（ECD） ECD是根据物质的电还原性和电氧化性来进行检测的，应用于对紫外光没有吸收或不能发出荧光，但具有电活性的物质测定。若结合衍生技术，也可应用于非电活性物质的检测。安培检测器和电导检测器在生化、医学、食品和环境分析中获得广泛的应用。
● 光电二极管阵列检测器（DAD） DAD的发展是HPLC技术最重要的进步。DAD在全部紫外波长上检测色谱信号。因此，不仅可以进行定量检测，而且可以提供组分的光谱定性信息。DAD在1s内，可快速扫描100000个检测数据，绘制出时间-吸光度-波长三维关系的立体色谱图。噪声低至3×10-6AU。目前，DAD已广泛应用于食品卫生化学检测、药物学、毒物学、临床医学、生命科学、环境科学、石油化工和高分子化工领域。
● 蒸发激光散射检测器（ELSD） ELSD有望成为像FID那样的通用型检测器。它可以对各种物质均有响应，且响应因子基本一致，其检测不依赖于样品分子的官能团，同时可以进行梯度洗脱。同RID和UVD比较，它消除了溶剂的干扰和因温度变化引起的基线漂移，灵敏度高。对于像磷脂、皂苷、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或吸收很小的化合物UVD无法进行检测，而ELSD对这些组分均有响应。ELSD没有流动相和杂质的紫外吸收干扰，提高了检测灵敏度和色谱峰的分辨率，ELSD测定无需定量校正因子，对所有组分的响应几乎一致。ELSD在食品分析中可应用于油酯类、糖、低聚糖、保健食品和保健药品等分析。
(二) 检测器联用技术
● 近年来检测器联用技术在食品化学分析中应用越来越普遍。L-M联用它既发挥了液相色谱柱对复杂化合物的分离能力，又体现了质谱的选择性、灵敏度、提供了组分分子量及结构信息。已广泛应用于氨基酸、抗生素、甾族化合物、食品污染物分析。HPLC-FTIR联机，已应用于药物与其代谢物，肽类、蛋白质分子量、分子结构等分析。HPLC-NMR联机，也应用于食品中糖类 （酒、果汁）、水质污染物、保健食品等分析。HPLC-AAS应用于磷化物，Si、Sn、Pb、As、S化合物的分离和测定；HPLC-AES适用于在线监测柱流出物中多种金属离子。HPLC-ICPAES是八十年代以后发展起来的联机技术，对许多金属离子的检测灵敏度达10-9g/mL～10-10g/mL，应用于生物样品中As、蛋白质、核糖核酸、Se等的测定。
● 近年来，随着微型柱（0.1㎜～0.5㎜id），微孔柱（0.5㎜～1㎜id）和毛细管液相色谱柱（0.05㎜～0.1㎜id）的发展，促进了液相色谱小型化。人们实现了将GC的通用检测器FID以及其他一些检测器与HPLC在线连接。HPLC-FID（TID、NPD、FPD、PID、ECD、TEA）。
三、HPLC法在食品分析中应用进展
(一) 食品添加剂
食品添加剂分析多采用RHPLC、IPC、HPICE；检测器应用最多的是紫外-可见光检测器（UVD），其次是电导检测器（CD）和折光示差检测器（RID）或采用UVD-RID，UVD-CD检测器的串联技术；色谱柱主要是C18柱，其次是阴离子色谱柱。同时，多种食品添加剂组分同时检测技术倍受关注。
● 甜味剂 HPLC法可以测定食品中糖精钠、甜味素、甜蜜素、安赛蜜、甘草苷、甜菊苷等多种甜味剂，其测定人工合成甜味剂最常用的方法为RHPLC-UVD法、阴离子交换色谱法、离子对色谱法。因此，常用检测器有UVD、CD；色谱柱为C18柱、阴离子交换柱和-NH2柱。
● 防腐剂 HPLC法测定防腐剂方法简便，灵敏，准确。其中，BA、CA、对羟基苯甲酸乙酯（丙酯）、脱氢乙酸均可采用RHPLC测定。UVD-RID串联可同时检测甜蜜素、BA和CA。
● 有机酸 采用UVD或RID检测器，C18柱的RHPLC法可同时测定食品中乳酸、酒石酸、苹果酸、醋酸、柠檬酸、延胡索酸、琥珀酸；或采用PICE法，电导检测器可以测定葡萄酒、酱油、酸奶、啤酒中柠檬酸、丙酮酸、琥珀酸、甲酸、乙酸、乳酸、乙酰丙酸、焦谷氨酸。
● 色素 HPLC可同时测定多种人工合成色素和天然色素。方法简便。如采用HPLC-UVD，C18柱分离的梯度洗脱系统可同时测定新红、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、赤藓红、亮蓝。
● 增白剂 RHPLC测定过氧化苯甲酰的最低检测浓度为0.04mg/kg。IC法可测定各类食品中H2SO3。AOAC990.31规定饮料中的亚硫酸盐利用磺化聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂柱的PICE进行分离，安培检测器检测。若以阴离子柱分离，CD检测食品中H2SO3，最低检测量0.2μg。
● 抗氧化剂 用RHPLC的梯度洗脱方式，可同时测定油脂中九种抗氧化剂。其最低检测浓度为2mg/kg，或以HPLC法同时分离PG、BHT、BHA，方法回收率分别为95.0%；99.0%；84.0%。
● 咖啡因 采用C18反相体系UVD可同时检测饮料中安赛蜜、糖精钠、咖啡因和甜味素，前三者最低检测浓度各为0.004mg/mL或单独测定饮料中咖啡因。
(二) 营养成分
● 氨基酸 采用RHPLC、IC法和氨基酸自动分析仪结合衍生技术可以测定食品中多种氨基酸，检测器有UVD和FD。常用衍生剂有PTTC、FMOC、AQC。
● 脂肪酸 目前，采用RHPLC法，以专用脂肪酸分离柱，实现了脂肪酸的快速分离。可以采用RID或UVD检测器。前者灵敏度低，后者需将无紫外吸收的脂肪酸衍生化，提高检测灵敏度。采用C18柱UVD检测了鱼油等油脂中硬脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。
● 碳水化合物 采用RID，氰基柱、氨基柱和C18柱可检测食品中多种糖类。AOAC995.13规定，利用非金属液相色谱系统，采用季胺盐、乳胶微珠附聚的二聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂柱，以脉冲安培检测器可检测即溶咖啡中游离碳水化合物和总碳水化合物（果糖除外）；以氨基柱或C18柱分离，RID检测果低聚糖浆和大豆等食品中果糖、棉子糖、蔗糖、葡萄糖、低聚糖等糖类。
● 维生素 目前，多采用UVD（FD）、C18柱的RHPLC测定食品中VA、VD、VE、VK、VC、叶酸、烟酰胺、泛酸。FD对维生素的检测应用少于UVD；采用IPC对多组分维生素的测定研究取得较大进展。加入庚烷磺离子对试剂，IPC可同时测定VB1、B2、B5、叶酸。以UVD，C18柱可同时测定VB1、咖啡因、烟酸、VB6、烟酰胺。VA具有强荧光性，因此采用FD比UVD灵敏度高。但当VA含量较高时，也可采用UVD检测。泛酸测定可以采用FD或UVD。但当组分预先经C8柱分离，经衍生化生成荧光物质，其灵敏度比UVD提高10～100倍。