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标题: 聚谷氨酸分子量大小测定 [打印本页]

作者: hu123 时间: 2014-8-27 15:33
标题: 聚谷氨酸分子量大小测定

一、实验目的

采用SDS-PAGE进行聚谷氨酸分子量大小的测定

二、实验材料

2.1 实验试剂

2.1.1 5×样品缓冲液：Tris-HCl 60 mmol/L，SDS 20 g/L，甘油 250 mL/L，巯基乙醇 14.4

mmol/L，溴酚兰1 g/L，pH 6.8。

考马斯亮蓝染液：将1.25 g考马斯亮蓝 R－250溶在230 mL甲醇与230 mL蒸馏水中，

搅拌1小时后加40 mL冰醋酸，过滤。

考马斯亮蓝脱色液：甲醇 300 mL，冰醋酸 100 mL，蒸馏水 600 mL。

2.2.2 电泳过程中所使用的溶液[47]

A液：丙烯酰胺溶液30%(W/V)，即丙烯酰胺29.2 g，甲叉双丙烯酰胺0.8 g，混合后，用蒸馏水溶解并定容至100 mL。

B液：4×分离胶缓冲液，即Tris-HCl 1.5 mol/L，SDS 4 g/L，pH 8.8。

C液：4×浓缩胶缓冲液，即Tris-HCl 0.5 mol/L，SDS 4 g/L，pH 6.8。

10%过硫酸氨：现用现配，取10 g过硫酸氨，用蒸馏水溶解并定容到100 mL。

电泳缓冲液：Tris碱 25 mmol/L，甘氨酸 192 mmol/L，SDS 1 g/L，pH 8.3。

2.2实验器材

电泳仪，电流槽

三、实验方法

3.1 将降解后的小分子聚谷氨酸配制成浓度为20 mg/mL的溶液2 mL，之后用SDS－

PAGE测定分子量。所用的标准蛋白分子量依次为14.4 KDa，20.2 KDa，26.0 KDa，35.0

KDa，45.0 KDa，66.2 KDa，94.0 KDa。电泳液的配制见试剂的配制一栏，凝胶的配制

见表2。按常规方法制备。

表2 电泳凝胶的配制

Tab.2 Preparation of gel electrophoresis

组分分离胶(12%) 浓缩胶(5%)

A 液 4.0 mL 0.67 mL

B 液 2.5 mL －

C 液－ mL

过硫酸氨 μ μL

蒸馏水 3.5 mL 2.3 mL

TEMED 5 μL 10 μL

3.2 具体操作如下：

（1）灌制分离胶

组装凝模具可按照使用说明书，装配好灌胶用的模具；

将A液、B液用蒸馏水在一个小烧瓶或试管中混合，丙烯酰胺（A液中）是神经毒素，

操作时必须使用手套；

加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀（过量气泡的产生会干扰聚合）。

凝胶很快会聚合，操作要迅速；

小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内，这样可以避免在凝胶内产生气泡；

当加入适量的分离胶溶液时，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1－5 mm的水层，这使

凝胶表面变得平整；

等待30～60 min，使凝胶聚合。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将会出现一个

清晰的界面，可以微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合。另外的办法是将灌完分离胶后的

剩余的凝胶溶液置于一个小容器内，作为检测凝胶聚合的标志。如果凝胶渗漏，但还没

有覆盖水层，可以回收分离胶溶液，重新装配玻璃板和隔片，在凝胶聚合之前重新灌胶，

胶聚合后将水层吸出。

（2）灌制浓缩胶

吸尽覆盖在分离胶上的水；

将A液、C液和蒸馏水在三角瓶中或小试管中混合；

加入过硫酸胺和TEMED，并轻轻搅拌使其混匀；

将浓缩胶溶液用吸管加至分离胶的上面，直到凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；

将15孔的梳子插入凝胶内，直到梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确保梳

子齿的末端没有气泡。

待胶聚合后（约30 min），小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂；

将凝胶放入电泳槽内，将电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡

在缓冲液中。

（3）制备样品和上样

样品的处理：γ－PGA样品（浓度约为20 mg/mL）与样品缓冲液按1:1的比例混合，

在100 ℃水浴处理2~5 min，Marker的处理方法相同。用微量注射器将样品加入样品孔中，

上样量为15 μL。将蛋白质样品加至样品孔的底部，并随着染料水平的升高而升高注射

器针头。避免带入气泡，气泡易使样品混入到相邻的加样孔中。

电泳条件：浓缩胶电压为120 V，进入分离胶后电压为140 V，2 h左右溴酚兰接近

胶边缘，结束电泳。

（4）储存液［49］

标准蛋白染色：用考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R250 2.5 g/L，用甲醇:水:冰乙

酸=4.5:4.5:1配制，V/V）染色过夜。

第一次脱色：凝胶从染色液中取出，用去离子水洗两次，再用脱色液（甲醇300 mL/L，

乙酸100 mL/L）在脱色摇床上脱色过夜。

复染：凝胶从前脱色液中取出，使标准蛋白着色后，水洗两次，再用阿利新兰8GX

对凝胶复染（0.5%的阿利新兰8GX，用0.3%的冰乙酸配制），染色20 min。

固定：凝胶从染色液中取出，置于60%乙醇溶液（V/V）中在脱色摇床中摇动40 min。

第二次脱色：凝胶从染色液中取出，用去离子水洗两次，最后用去离子水置于脱色

摇床上脱色过夜，期间更换脱色液3－4次。

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